3.1.1. Sơ đồ nghiên cứu
3.1.2. Xử lý nguyên liệu 3.1.2.1 . Nguyên liệu 3.1.2.1 . Nguyên liệu
Quả Bứa đƣợc thu hái tại thôn Bình Hòa, xã Bình Hải, huyện Bình Sơn, tỉnh Quảng Ngãi vào tháng 6–7. Quả Bứa chín có màu vàng, quả mộng mang đài tồn tại, vỏ quả dày, có mùi thơm, phần vỏ rất chua, phần ruột có vị chua ngọt.
pH Thể tích Thời gian Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng Đo phổ IR Đo HPLC Canxi hydroxycitrat tinh khiết Tinh chế Xác định hàm lƣợng Canxi Tổng hợp Canxi hydroxycitrat Xác định tổng lƣợng axit Định lƣợng các axit (HPLC) Dịch chiết HCA Chiết tách HCA Hàm lƣợng tro Thành phần kim loại
Nguyên liệu sau khi xử lý Xử lý nguyên liệu Xác định độ ẩm Quả bứa
Làm sạch
Hong khô
3.1.2.2. Làm sạch nguyên liệu
Quả Bứa sau khi thu hái còn chứa nhiều tạp chất, để cho quá trình chiết tách đạt hiệu quả cao thì giai đoạn làm sạch nguyên liệu phải thật cẩn thận. Các tạp chất trong quả chủ yếu là lớp bụi bẩn bám trên bề mặt quả, những quả còn non hay những quả bị hƣ thối. Vì vậy sau khi thu hái nguyên liệu về cần phải loại bỏ những tạp chất này bằng cách cho quả vào chậu lớn và cho nƣớc ngập quả. Ngâm quả khoảng 5 phút, dùng tay khuấy đều và chà xát quả để làm trôi hết bụi bẩn còn bám trên quả rồi vớt ra rá có lỗ để ráo nƣớc. Tiến hành rửa 03 lần để quả sạch hoàn toàn.
3.1.2.3. Hong khô
Quả Bứa sau khi rửa sạch vẫn còn nhiều nƣớc nên ta phải làm cho lớp nƣớc trên bề mặt khô hết. Để quá trình hong khô đƣợc nhanh ta dùng tay vẩy mạnh rá đựng nhiều lần hay lau quả bằng vải sạch. Sau khi lƣợng nƣớc đã giảm bớt ta có thể để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng cho đến khi quả khô hoàn toàn.
3.1.2.4. Xay nhỏ
Quả Bứa sau khi rửa sạch, hong khô tiến hành bổ quả để loại bỏ ruột và hạt. Vỏ quả đƣợc cắt thành mẫu nhỏ có kích thƣớc bằng ngón tay út (hình 3.1) đem sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 700C trong vòng 28 giờ đến khi vỏ quả khô hoàn toàn, xay vỏ quả khô thành bột mịn (hình 3.2) và sử dụng để chiết axit hữu cơ.
3.2. XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM, HÀM LƢỢNG TRO, THÀNH PHẦN KIM LOẠI TRONG VỎ QUẢ BỨA TRONG VỎ QUẢ BỨA
3.2.1. Xác định độ ẩm
Dụng cụ, thiết bị: Cốc thủy tinh để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích.
Để xác định độ ẩm trong vỏ thì sau khi thu hái về ta loại bỏ những quả bị hƣ tổn, những quả non, chọn những quả chín mọng tách bỏ phần ruột chỉ lấy phần vỏ và tiến hành làm sạch, hong khô. Trong quá trình hong khô ta để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 24h rồi tiến hành xác định độ ẩm.
Cân khoảng 10g vỏ Bứa tƣơi cho vào cốc thủy tinh đã đƣợc sấy khô và biết khối lƣợng chính xác, sau đó cho vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 800
C trong 3h. Sau khi sấy ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm đến khi cốc thủy tinh nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích. Sau đó cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hay có sai số khoảng 0,005g thì dừng quá trình sấy.
Dựa vào các kết quả thu đƣợc, ta tính đƣợc khối lƣợng vỏ quả Bứa trƣớc và sau khi sấy. Từ đó, ta tính đƣợc độ ẩm trong vỏ quả Bứa dựa vào công thức sau:
100 1 o o m m m H Trong đó: - H: độ ẩm (%)
- m0: khối lƣợng vỏ quả tƣơi trƣớc khi sấy (g) - m1: khối lƣợng vỏ quả sau khi sấy (g)
Bảng 3. 1 : Kết quả xác định độ ẩm trong vỏ quả Bứa
STT mẫu Khối lƣợng vỏ trƣớc khi sấy (g) Khối lƣợng vỏ sau khi sấy (g) Khối lƣợng nƣớc trong vỏ (g) Độ ẩm (%) 1 10,097 9,249 0,848 8,39 2 10,098 9,277 0,821 8,13 3 10,099 9,230 0,869 8,61
Nhận xét: Độ ẩm trong vỏ quả bứa khô thấp, khoảng 8,37 ± 0,24%, độ ẩm trung bình trong vỏ quả là 8,37%.
3.2.2. Xác định hàm lƣợng tro
Dụng cụ, thiết bị: Cốc sứ đựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích. Để xác định hàm lƣợng tro trong vỏ quả, ta cân khoảng 4g vỏ đã đƣợc sấy khô cho vào cốc sứ đã sấy khô và biết chính xác khối lƣợng. Cho cốc sứ có chứa vỏ
vào lò nung và nung ở 8000
C. Sau 6h ta thấy vỏ đã đƣợc tro hóa hoàn toàn. Lúc này tro có dạng bột mịn, màu trắng. dùng kẹp dài lấy bát sứ ra khỏi lò nung, cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và tính khối lƣợng. Sau 30 phút tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần liên tiếp là không đổi hay sai số 0,0001 g thì dừng quá trình tro hóa.
Hàm lƣợng tro trong vỏ đƣợc tính theo công thức:
100 0 1 m m H Trong đó:
- H: hàm lƣợng tro trong vỏ sấy khô (%) - m0: khối lƣợng vỏ khô trƣớc khi tro hóa (g) - m1: khối lƣợng vỏ sau khi tro hóa (g)
Bảng 3. 2 : Kết quả xác định tỉ lệ tro trong vỏ quả Bứa sấy khô
STT mẫu Khối lƣợng vỏ đã sấy khô (g) Khối lƣợng cốc (g) Khối lƣợng vỏ sấy khô + cốc trƣớc khi tro hóa
(g)
Khối lƣợng vỏ + cốc sau khi tro hóa (g)
Khối lƣợng tro (g) Tỉ lệ tro (%) 1 4,039 16,750 20,789 16,792 0,042 1,04 2 4,150 19,560 23,710 19,603 0,043 1,03 3 4,221 32,120 36,341 32,166 0,046 1,09
Nhận xét: Hàm lƣợng tro trong vỏ quả bứa khô khoảng 1,06 ± 0,03%. Nhƣ vậy hàm lƣợng tro trong vỏ quả khô là rất thấp.
3.2.3. Xác định thành phần kim loại nặng
Lấy 0,1 g tro đi đo quang phổ hấp phụ nguyên tử AAS để xác định hàm lƣợng kim loại nặng chủ yếu trong vỏ quả Bứa.
Bảng 3. 3 : Kết quả xác định thành phần kim loại nặng trong vỏ quả Bứa STT Tên kim loại Phƣơng pháp thử AAS Kết quả Tiêu chuẩn CODEX STAN 164 – 1989 (mg/kg) Hàm lƣợng cho phép (mg/kg) 1 Sn TCVN 6193 – 1996 0,0043 200,0 40 2 Pb TCVN 6193 – 1996 0,6715 0,30 2 3 Zn TCVN 6193 – 1996 5,3224 5,00 40 4 Cu TCVN 6193 – 1996 2,2675 5,00 30 5 Fe TCVN 6177 – 1996 26,512 15,0 x 6 As TCVN 6193 – 1996 KPH 0,20 1 7 Tổng Cu, Zn, Fe 30,1019 20 x
Nhận xét: Thành phần kim loại nặng trong vỏ quả Bứa thấp, kết quả so sánh với tiêu chuẩn CODEX STAN 164 – 1989: Tiêu chuẩn về chất lƣợng trái cây và hàm lƣợng kim loại nặng cho phép trong các loại rau quả quy định tại Quyết định số 867/1998/QĐ – BYT của Bộ Y Tế ngày 04/04/1998 về việc ban hành Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lƣơng thực, thực phẩm thì các hàm lƣợng kim loại nặng nằm trong khoảng cho phép. Nhƣ vậy, có thể sử dụng vỏ quả Bứa để làm thực phẩm hoặc dƣợc phẩm mà không ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời.
3.3. CHIẾT TÁCH AXIT HỮU CƠ 3.3.1. Chuẩn bị mẫu 3.3.1. Chuẩn bị mẫu
Vỏ quả Bứa khô: Quả Bứa sau khi rửa sạch, hong khô tiến hành bổ quả để loại bỏ phần ruột và hạt. Vỏ quả đƣợc cắt thành mẫu nhỏ có kích thƣớc bằng ngón tay út, đem sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 800C trong vòng 28 giờ đến khi vỏ quả khô hoàn toàn, xay thành bột mịn và sử dụng để chiết tách axit hữu cơ.
3.3.2. Chiết tách axit hữu cơ
Chƣng ninh trong nồi áp suất (hình 3.3):
Cân khoảng 10g mẫu vỏ quả khô cho vào cốc thủy tinh 500ml với 150ml nƣớc cất. Thực hiện chƣng ninh trong nồi áp suất ở nhiệt độ 1270C, áp suất 0,15Mpa trong
thời gian 1 giờ. Tiến hành lọc bằng vải lọc muslin và thu dịch chiết, phần xác thực hiện chiết lặp một lần nữa để thu hồi toàn bộ lƣợng axit có trong mẫu. Phần xác sau khi chiết lặp 2 lần không còn vị chua, thử bằng giấy đo pH cho pH trung tính. Dịch chiết có màu nâu đỏ (hình 3.4). Trộn lẫn dịch 2 lần chiết với 4g than hoạt tính và ngâm trong nƣớc ấm 30 phút, sau đó lọc chân không
dùng phễu Buchne. Than hoạt tính đƣợc rửa lại 2 lần, mỗi lần với 10ml nƣớc để thu hồi hết axit. Dịch chiết sau khi xử lý bằng than hoạt tính bị mất màu hoàn toàn (hình 3.5). Trộn lẫn dịch lọc và rửa, cô đặc đến 50ml, xử lý với 100ml etanol 960, 15 phút để kết tủa hết pectin (hình 3.7) (kết tủa màu trắng sữa). Ly tâm khoảng 10–15 phút trong máy ly tâm 4000 vòng/phút hay lọc, tách phần dịch nổi và kết tủa riêng. Phần kết tủa rửa 2 lần với 20ml etanol và ly tâm hoặc lọc để thu hồi hết axit. Trộn các dịch nổi, cô đặc đến thể tích 50ml (hình 3.6) và lƣu giữ ở 40C trong tủ lạnh đến khi sử dụng để chuẩn độ, kiểm tra bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
Hình 3.3: Nồi áp suất
Hình 3.7: Kết tủa pectin Hình 3.4: Dịch chiết
chưa tẩy màu
Hình 3.5: Dịch
3.3.3. Đánh giá cảm quan mẫu chiết
Mẫu thu đƣợc sau quá trình chiết và làm sạch là hỗn hợp dạng lỏng, có màu trong suốt hơi vàng (hình 3.8), có vị chua đặc trƣng pha lẫn vị chát. Thử dịch chiết bằng giấy đo pH cho kết quả dung dịch có pH = 2 – 4. Do đó ta có thể kết luận trong mẫu dịch chiết có chứa axit.
Theo kết quả đánh giá cảm quan đối với mẫu vỏ quả Bứa khô đã thực hiện chiết lặp 2 lần cho thấy không còn vị chua. Để kiểm tra trong mẫu vỏ quả sau khi chiết 2 lần có còn axit hay không ta thực hiện chiết lần 3 rồi kiểm tra bằng giấy đo pH cho môi trƣờng trung tính (6–7). Mẫu dịch chiết lặp 2 lần đƣợc lƣu giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40
C và sử dụng để chuẩn độ, kiểm tra bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
3.4. KIỂM TRA SẢN PHẨM CHIẾT BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ VÀ SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC) VÀ SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC)
3.4.1. Xác định tổng lƣợng axit trong mẫu chiết bằng phƣơng pháp chuẩn độ
Kết quả xác định tổng lƣợng axit trong mẫu chiết từ vỏ quả Bứa khô bằng phƣơng pháp chuẩn độ thu đƣợc kết quả trình bày ở bảng 3.4 dƣới đây.
Bảng 3. 4 : Kết quả xác định tổng lƣợng axit trong vỏ quả Bứa
STT P (g) Vcđ (ml) V (ml) n (ml) Tổng lƣợng axit (g/100g) Tổng lƣợng axit trung bình (g/100g) 1 10,000 50 5 25,9 17,88 16,06 26,0 17,95 26,1 18,02 2 10,095 50 5 23,9 16,35 24,0 16,42 24,1 16,48 3 10,105 50 5 20,2 13,80 20,3 13,87 20,1 13,73
Nhận xét: Tổng lƣợng axit chuẩn độ đƣợc trong mẫu vỏ Bứa khô chiết với dung môi nƣớc là 16,06%. So sánh với kết quả của các loài đã nghiên cứu nhƣ:
Garcinia cambogia (17–19,2%), Garcinia india (12,48–15,1%), Garcinia cowa (27,1%) thì kết quả vỏ quả bứa Việt Nam chiết trong nƣớc cho kết quả trung bình.
3.4.2. Xác định HCA trong mẫu chiết bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Phƣơng pháp chuẩn độ axit – bazơ có thể sử dụng để xác định tổng lƣợng axit hữu cơ trong dịch chiết. Tuy nhiên, trong phƣơng pháp này không thể định lƣợng axit hydroxycitric và axit citric một cách riêng biệt. Ta cũng có thể xác định các axit bằng phƣơng pháp sắc kí khí, trong phƣơng pháp sắc kí khí ta phải sấy mẫu. Tuy nhiên axit (-)-HCA có khuynh hƣớng bị lacton hoá khi có tác nhân nhiệt. Mặt khác (-)-HCA hút ẩm cao trong điều kiện thƣờng càng làm khó khăn cho việc sấy mẫu. Trong phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp, ta có thể định lƣợng HCA và các axit hữu cơ khác mà không cần phải cô đặc, sấy, hoá hơi dịch chiết. Đây là điểm thuận lợi để ta có thể định lƣợng (-)-HCA và các axit hữu cơ một cách riêng biệt.
Chất chuẩn: (-)-Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate, cung cấp bởi hãng: Sigma-Aldrich, công thức phân tử: C12H10Ca3O16.xH2O.
Chuẩn bị HCA tự do
Calcium threo – hydroxycitrate tribasic hydrate (50 mg) cho vào cốc 50ml chứa 5,0 ml nƣớc và xử lý với 500 mg Dowex 50 [H+]. Hỗn hợp đƣợc khuấy trong thời gian 10 phút và sử dụng khuấy từ. Tách lấy phần dung dịch và nhựa đƣợc rửa với nƣớc có pH trung tính. Nƣớc rửa và dung dịch đƣợc trộn lẫn và làm thành 25ml, khuấy trộn và lọc bằng giấy lọc. Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10 – 320 ppm.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit citric cho HPLC
Dung dịch chuẩn axit citric đƣợc chuẩn bị riêng biệt có nồng độ từ 2 đến 30 ppm sử dụng nƣớc cất 03 lần cất.
HPLC phân tích
Điều kiện sắc ký để xác định HCA và axit citric trên máy sắc ký lỏng cao áp Knauer, cột sắc kí Knauer C18, detectơ UV–VIS, bƣớc sóng 210 nm. Pha động gồm (A) metanol MeOH và (B) là axit photphoric 0,01 M với tốc độ dòng 1,5 ml/m, B:A theo tỉ lệ (9:1).
Xây dựng đƣờng chuẩn
Phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc thực hiện bằng cách dựa vào kết quả phân tích một chuỗi các mẫu HCA chuẩn. Năm mẫu dung dịch chuẩn chứa 10– 320 ppm HCA tự do đƣợc tiêm vào HPLC, thao tác rửa giải đƣợc thực hiện nhƣ trên, kết quả thu đƣợc các diện tích pic. Đƣờng cong HCA đƣợc vẽ dựa trên biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của HCA và diện tích pic (trung bình của 03 lần chạy).
Đƣờng chuẩn của axit citric đƣợc tiêm vào HPLC đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ trên và thu đƣợc các diện tích pic. Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc xác định dựa vào nồng độ thực của HCA có trong mẫu. Khoảng nồng độ này đƣợc tính từ giá trị giới hạn dƣới (LLOQ) đến giá trị giới hạn trên (ULOQ).
Xác định giá trị giới hạn
Giá trị giới hạn (LOQ) đƣợc định nghĩa nhƣ nồng độ thấp nhất của HCA mà có thể xác định với độ tin cậy và chính xác < 20%.
Xác định axit hữu cơ có trong mẫu
Mẫu đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loãng theo tỉ lệ 1:100 với nƣớc cất 02 lần cất. Thể tích của mỗi mẫu đƣợc tiêm vào HPLC là 20L, HCA; axit citric thu đƣợc trực tiếp dựa vào diện tích pic bằng cách áp dụng hệ số pha loãng và sử dụng đƣờng chuẩn.
Nồng độ của HCA và axit citric trong mẫu đƣợc trình bày bằng g/100 g mẫu và đƣợc tính theo công thức sau:
% HCA, CA = [(SI * Am) – Int] * Vcđ * Kpl * 10000 / m
Trong đó:
SI : Hệ số góc đƣờng chuẩn Int : Hệ số b của đƣờng chuẩn Am : Diện tích pic sắc kí Vcđ : Thể tích mẫu cô đặc (ml) Kpl : Hệ số pha loãng m : Trọng lƣợng mẫu thử (g)
3.4.2.1. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn
Đƣờng chuẩn đƣợc xác định bằng cách thay đổi nồng độ của 05 mẫu chuẩn từ 10 đến 320 ppm. Phƣơng trình đƣờng chuẩn HCA là: C = 1,37A – 6,88 với A là diện tích pic của HCA, C là nồng độ HCA và hệ số tƣơng quan R2
= 0,999698 (hình 3.9)
Hình 3.9: Đƣờng chuẩn HCA
Phƣơng trình đƣờng chuẩn axit citric là: C = 2.55A – 5,43 với A là diện tích pic của citric, C là nồng độ citric và hệ số tƣơng quan R2
= 0,999799 (hình 3.10)
Hình 3.10: Đƣờng chuẩn axit citric 3.4.2.1. Kết quả xác định axit hữu cơ trong vỏ quả Bứa
Thành phần axit hữu cơ xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp đƣợc tính bằng công thức sau:
Công thức tính HCA: Cm (ppm) = (1,37 * Am – 6,88) * Vcđ * Kpl / m
Công thức tính CA: Cm (ppm) = (2,55 * Am – 5,43) * Vcđ * Kpl / m Cm (%) = Cm (ppm) / 10000
Trong đó:
Cm (ppm): Nồng độ tính bằng ppm Cm (%) : Nồng độ phần trăm Am : Diện tích pic sắc kí Vcđ : Thể tích mẫu cô đặc (ml) Kpl : Hệ số pha loãng m : Trọng lƣợng mẫu thử (g)
Bảng 3. 5 : Kết quả xác định axit hữu cơ trong vỏ quả Bứa bằng HPLC