Phƣơng pháp chuẩn độ axit – bazơ có thể sử dụng để xác định tổng lƣợng axit hữu cơ trong dịch chiết. Tuy nhiên, trong phƣơng pháp này không thể định lƣợng axit hydroxycitric và axit citric một cách riêng biệt. Ta cũng có thể xác định các axit bằng phƣơng pháp sắc kí khí, trong phƣơng pháp sắc kí khí ta phải sấy mẫu. Tuy nhiên axit (-)-HCA có khuynh hƣớng bị lacton hoá khi có tác nhân nhiệt. Mặt khác (-)-HCA hút ẩm cao trong điều kiện thƣờng càng làm khó khăn cho việc sấy mẫu. Trong phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp, ta có thể định lƣợng HCA và các axit hữu cơ khác mà không cần phải cô đặc, sấy, hoá hơi dịch chiết. Đây là điểm thuận lợi để ta có thể định lƣợng (-)-HCA và các axit hữu cơ một cách riêng biệt.
Chất chuẩn: (-)-Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate, cung cấp bởi hãng: Sigma-Aldrich, công thức phân tử: C12H10Ca3O16.xH2O.
Chuẩn bị HCA tự do
Calcium threo – hydroxycitrate tribasic hydrate (50 mg) cho vào cốc 50ml chứa 5,0 ml nƣớc và xử lý với 500 mg Dowex 50 [H+]. Hỗn hợp đƣợc khuấy trong thời gian 10 phút và sử dụng khuấy từ. Tách lấy phần dung dịch và nhựa đƣợc rửa với nƣớc có pH trung tính. Nƣớc rửa và dung dịch đƣợc trộn lẫn và làm thành 25ml, khuấy trộn và lọc bằng giấy lọc. Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10 – 320 ppm.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit citric cho HPLC
Dung dịch chuẩn axit citric đƣợc chuẩn bị riêng biệt có nồng độ từ 2 đến 30 ppm sử dụng nƣớc cất 03 lần cất.
HPLC phân tích
Điều kiện sắc ký để xác định HCA và axit citric trên máy sắc ký lỏng cao áp Knauer, cột sắc kí Knauer C18, detectơ UV–VIS, bƣớc sóng 210 nm. Pha động gồm (A) metanol MeOH và (B) là axit photphoric 0,01 M với tốc độ dòng 1,5 ml/m, B:A theo tỉ lệ (9:1).
Xây dựng đƣờng chuẩn
Phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc thực hiện bằng cách dựa vào kết quả phân tích một chuỗi các mẫu HCA chuẩn. Năm mẫu dung dịch chuẩn chứa 10– 320 ppm HCA tự do đƣợc tiêm vào HPLC, thao tác rửa giải đƣợc thực hiện nhƣ trên, kết quả thu đƣợc các diện tích pic. Đƣờng cong HCA đƣợc vẽ dựa trên biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của HCA và diện tích pic (trung bình của 03 lần chạy).
Đƣờng chuẩn của axit citric đƣợc tiêm vào HPLC đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ trên và thu đƣợc các diện tích pic. Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc xác định dựa vào nồng độ thực của HCA có trong mẫu. Khoảng nồng độ này đƣợc tính từ giá trị giới hạn dƣới (LLOQ) đến giá trị giới hạn trên (ULOQ).
Xác định giá trị giới hạn
Giá trị giới hạn (LOQ) đƣợc định nghĩa nhƣ nồng độ thấp nhất của HCA mà có thể xác định với độ tin cậy và chính xác < 20%.
Xác định axit hữu cơ có trong mẫu
Mẫu đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loãng theo tỉ lệ 1:100 với nƣớc cất 02 lần cất. Thể tích của mỗi mẫu đƣợc tiêm vào HPLC là 20L, HCA; axit citric thu đƣợc trực tiếp dựa vào diện tích pic bằng cách áp dụng hệ số pha loãng và sử dụng đƣờng chuẩn.
Nồng độ của HCA và axit citric trong mẫu đƣợc trình bày bằng g/100 g mẫu và đƣợc tính theo công thức sau:
% HCA, CA = [(SI * Am) – Int] * Vcđ * Kpl * 10000 / m
Trong đó:
SI : Hệ số góc đƣờng chuẩn Int : Hệ số b của đƣờng chuẩn Am : Diện tích pic sắc kí Vcđ : Thể tích mẫu cô đặc (ml) Kpl : Hệ số pha loãng m : Trọng lƣợng mẫu thử (g)
3.4.2.1. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn
Đƣờng chuẩn đƣợc xác định bằng cách thay đổi nồng độ của 05 mẫu chuẩn từ 10 đến 320 ppm. Phƣơng trình đƣờng chuẩn HCA là: C = 1,37A – 6,88 với A là diện tích pic của HCA, C là nồng độ HCA và hệ số tƣơng quan R2
= 0,999698 (hình 3.9)
Hình 3.9: Đƣờng chuẩn HCA
Phƣơng trình đƣờng chuẩn axit citric là: C = 2.55A – 5,43 với A là diện tích pic của citric, C là nồng độ citric và hệ số tƣơng quan R2
= 0,999799 (hình 3.10)
Hình 3.10: Đƣờng chuẩn axit citric 3.4.2.1. Kết quả xác định axit hữu cơ trong vỏ quả Bứa
Thành phần axit hữu cơ xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp đƣợc tính bằng công thức sau:
Công thức tính HCA: Cm (ppm) = (1,37 * Am – 6,88) * Vcđ * Kpl / m
Công thức tính CA: Cm (ppm) = (2,55 * Am – 5,43) * Vcđ * Kpl / m Cm (%) = Cm (ppm) / 10000
Trong đó:
Cm (ppm): Nồng độ tính bằng ppm Cm (%) : Nồng độ phần trăm Am : Diện tích pic sắc kí Vcđ : Thể tích mẫu cô đặc (ml) Kpl : Hệ số pha loãng m : Trọng lƣợng mẫu thử (g) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3. 5 : Kết quả xác định axit hữu cơ trong vỏ quả Bứa bằng HPLC
STT mẫu m (g) Am Vcđ Kpl
HCA (%)
Axit citric (%)
HCA Axit citric
1 10,016 157,143 5,281 50 100 10,404 0,401 2 10,105 161,067 5,333 50 100 10,578 0,404 3 10,095 159,315 5,309 50 100 10,469 0,402
Nhận xét: Axit chủ yếu đƣợc tìm thấy trong vỏ quả Bứa bằng HPLC là HCA đƣợc thể hiện trên sắc kí đồ hình 3.12. Pic thứ yếu đƣợc xác định là pic của axit citric. Xác định pic HCA đƣợc dựa vào pic của axit HCA chuẩn xuất hiện ở thời gian lƣu là 4,939 phút, tƣơng tự pic của axit citric xác định nhờ pic axit chuẩn xuất hiện ở thời gian lƣu là 5,623 phút (hình 3.11). Thời gian lƣu của HCA và axit citric tìm thấy trong mẫu là 4,955 phút và 5,606 phút.
Hình 3.11: Sắc kí đồ mẫu axit HCA và axit citric chuẩn
Hình 3.12: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả Bứa khô chiết trong nƣớc