3.4.1 Xác định tổng lƣợng axit trong dịch chiết bằng phƣơng pháp chuẩn độ
Kết quả xác định tổng lƣợng axit trong dịch chiết bằng phƣơng pháp chuẩn độ đƣợc trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4: Kết quả xác định tổng lƣợng axit trong lá bứa khô
Nhận xét:
Tổng lƣợng axit chuẩn độ đƣợc trong dịch chiết của lá bứa khô là: 2,93%. So sánh với các loài đã nghiên cứu nhƣ: Garcinia Indica (5,88- 6,99%), Garcina Cowa (4,457%) thì kết quả chiết bằng nƣớc của lá bứa khô là thấp.
3.4.2 Xác định HCA trong mẫu chiết bằng phƣơng pháp HPLC
Phƣơng pháp chuẩn độ axit- bazơ đƣợc dùng để xác định tổng lƣợng các axit hữu cơ có mặt trong lá bứa khô. Tuy nhiên, phƣơng pháp này không giúp ta định lƣợng
Mẫu P (g) Vcd (ml) V (ml) n (ml) X (g/100g) X (g/100g)
1 10,535 100 10 4,4 2,88
2,93
2 10,547 100 10 4,9 3,21
đƣợc axit hydroxycitric (HCA) riêng biệt với các axit hữu cơ khác. Chính vì thế, ta lựa chọn phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lƣợng và định tính HCA. Bởi vì, phƣơng pháp này có ƣu điểm là không cần cô đặc, sấy hoặc hóa hơi mẫu trƣớc khi đo nhƣ sắc ký khí.
3.4.2.1. Xây dựng đƣờng chuẩn
Chất chuẩn: (-)-Calcium threo- hydroxycitrat tribasic hydrate
Đƣờng chuẩn đƣợc xác định bằng cách thay đổi nồng độ của 5 mẫu dung dịch chuẩn. Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng với nồng độ thay đổi từ 10ppm đến 320ppm, phƣơng trình đƣờng chuẩn là:
C=1,34A-6,88
Với: A: là diện tích pic của HCA
C: là nồng độ của HCA
Hệ số tƣơng quan R2= 0,999
Hình 3.6: Đồ thị đƣờng chuẩn của HCA 3.4.2.2. Kết quả xác định axit HCA trong lá bứa
HCA thu đƣợc dựa vào diện tích pic, bằng cách áp dụng hệ số pha loãng và sử dụng đƣờng chuẩn. Nồng độ của HCA trong mẫu đƣợc xác định công thức sau:
10000 % Mn Kpl Vdm Int Am SI HCA
Trong đó: SI: hệ số góc đƣờng chuẩn Int: hệ số b của đƣờng chuẩn
Am: diện tích pic sắc ký
Vđm: thể tích mẫu sau khi cô đặc sử dụng cho HPLC (ml) Kpl: hệ số pha loãng
Mn: khối lƣợng mẫu (g)
Từ đồ thị đƣờng chuẩn HCA (hình 3.6), ta xác định thành phần HCA bằng công thức cụ thể sau:
Cm%= (1,34*Am- 6,88)*Vđm*Kpl/10000*Mn Kết quả: đƣợc thể hiện trong bảng 3.5 sau đây:
Bảng 3.5: Kết quả xác định HCA trong lá bứa bằng HPLC
STT Mn (g) Am Vđm Kpl %HCA
1 10,535 85,112 100 25 2,543 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2 10,547 87,348 100 25 2,611
3 10,496 85,102 100 25 2,552
Hình 3.7: Sắc ký đồ axit HCA chuẩn Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu lá bứa chiết trong nƣớc
Nhận xét
Axit tìm thấy chủ yếu trong lá bứa khô bằng phƣơng pháp HPLC là HCA, chiếm 2,569g/100g. Xác định pic HCA đƣợc dựa vào pic của axit HCA chuẩn (theo công bố của Đặng Quang Vinh 9) (hình 3.7) xuất hiện với thời gian lƣu là 4,939 phút. Thời
gian lƣu HCA tìm thấy trong dịch chiết là 5,058 phút đƣợc thể hiện trên sắc kí đồ (hình 3.8)
3.5 TỔNG HỢP MUỐI MAGIÊ HYDROXYCITRAT
Tiến hành
Dịch chiết axit thu đƣợc, sau khi tẩy màu bằng than hoạt tính và xử lý kết tủa pectin, đem cho tác dụng với bột MgO dƣ cho đến khi phản ứng xảy ra hoàn toàn. Lọc bỏ lƣợng MgO dƣ thu đƣợc dịch có màu vàng nâu.
Cho cồn 960
vào dịch vừa thu đƣợc sau phản ứng dùng đũa thủy tinh khuấy đều, thấy xuất hiện kết tủa dạng hạt nhỏ dẻo giống kẹo mạch nha lắng xuống đáy cốc. Để lắng tách bỏ phần dịch lọc thu đƣợc chất rắn có màu vàng nhạt (hình 3.9).
Cho cồn tuyệt đối vào cốc chứa chất rắn vừa thu đƣợc. Dùng muỗng chà mịn chất rắn thành bột mịn trong cồn tuyệt đối. Tách bỏ dịch lọc thu đƣợc chất rắn ở dạng bột mịn.
Chất rắn này đƣợc ngâm và rửa nhiều lần với cồn 960. Sau đó, ngâm trong cồn tuyệt đối qua đêm để làm sạch.
Cuối cùng, tách bỏ phần dịch thu chất rắn và cho phần chất rắn này vào tủ sấy khô ở nhiệt độ 1000C trong vòng 48 giờ, thu đƣợc muối magiê hydroxycitrat dạng bột mịn hơi vàng (hình 3.9). Đem cân khối lƣợng muối thu đƣợc. Tiến hành đo HPLC và một số kim loại nặng của muối thu đƣợc.
Hình 3.9: Muối magiê trƣớc và sau khi sấy
3.6 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN TỔNG LƢỢNG MUỐI THU ĐƢỢC
Dịch chiết axit thu đƣợc sau khi tẩy màu với than hoạt tính và xử lý kết tủa pectin, đem đi cô đặc đến các thể tích sau: 50ml, 100ml, 150ml, 200ml, 250ml
Cho dịch chiết tác dụng với MgO dƣ, đun nóng ở nhiệt độ 800
C trong vòng 5 phút. Đến khi phản ứng xảy ra hoàn toàn (pH=8-10), lọc bỏ MgO dƣ, thu đƣợc dịch có màu vàng nâu.
Cho cồn 960
vào dịch chiết vừa mới thu đƣợc, dùng đũa thủy tinh khuấy đều thấy xuất hiện kết tủa dạng hạt nhỏ dẻo nhƣ kẹo mạch nha lắng xuống đáy cốc. Để lắng, tách bỏ dịch chiết thu đƣợc chất rắn có màu vàng nhạt.
Cho cồn tuyệt đối vào cốc chứa chất rắn thu đƣợc, dùng muỗng chà mịn chất rắn trong cồn tuyệt đối. Tách bỏ dịch lọc thu đƣợc chất rắn ở dạng bột mịn.
Chất rắn này đƣợc ngâm và rửa nhiều lần với cồn 960
. Sau đó ngâm chất rắn vào cồn tuyệt đối qua đêm để làm sạch.
Cuối cùng, tách bỏ phần dịch thu đƣợc chất rắn, cho chất rắn này vào tủ sấy khô ở nhiệt độ 1000C, trong vòng 48 giờ, thu đƣợc muối magiê hidroxycitrat bột mịn hơi vàng. Cân khối lƣợng muối vừa thu đƣợc và tính hiệu suất của phản ứng.
Kết quả khảo sát yếu tố thể tích axit ảnh hƣởng đến tổng lƣợng muối thu đƣợc đƣợc thể hiện qua bảng 3.6 và đồ thị hình 3.10
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát sự phụ thuộc tổng lƣợng muối thu đƣợc vào thể tích axit STT Khối lƣợng mẫu (g) Lƣợng axit (g) Thể tích axit (ml) Lƣợng muối theo lý thuyết (g) Lƣợng muối theo thực tế (g) Hiệu suất (%) 1 200,065 5,134 50 5,949 2,230 37,485 2 200,450 5,150 100 5,967 2,746 46,020 3 200,521 5,151 150 5,968 3,069 51,416 4 200,405 5,148 200 5,965 2,849 47,762 5 200,113 5,140 250 5,955 2,512 42,183
Hình 3.10: Đồ thị sự phụ thuộc tổng lƣợng muối thu đƣợc vào thể tích axit (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận xét:
Khối lƣợng muối magiê hydroxycitrat tổng hợp đƣợc đạt khối lƣợng lớn nhất là 3,069g (H= 51,416%), ứng với thể tích là 150ml.
3.6.2 Khảo sát theo nhiệt độ thực hiện phản ứng
Các bƣớc tiến hành thực hiện nhƣ trên. Ta cố định một số thông số kỹ thuật sau: - Thể tích axit: 150ml
- Thời gian thực hiện phản ứng: 5 phút
Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ bằng cách cho thông số này biến thiên với các giá trị: 500
C ,600C, 700C, 800C và 900C.
Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của tổng lƣợng muối thu đƣợc vào nhiệt độ chuyển hóa đƣợc biểu diễn bằng bảng 3.7 và hình 3.11
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của tổng lƣợng muối thu đƣợc vào nhiệt độ STT Khối lƣợng mẫu (g) Lƣợng axit (g) Nhiệt độ (0C) Lƣợng muối theo lý thuyết (g) Lƣợng muối theo thực tế (g) Hiệu suất (%) 1 200,317 5,146 50 5,962 2,102 35,257 2 200,364 5,147 60 5,964 2,411 40,425 3 200,476 5,150 70 5,967 2,789 46,740 4 200,585 5,153 80 5,971 3,083 51,633 5 200,247 5,144 90 5,960 2,900 48,658 Thể tích axit (ml) 0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 50 100 150 200 250 (g)
Hình 3.11: Đồ thị sự phụ thuộc tổng lƣợng muối thu đƣợc vào nhiệt độ
Nhận xét: Thực hiện chuyển hóa ở 800
C khối lƣợng muối thu đƣợc lớn nhất là: 3,083g, đạt hiệu suất H= 51,633%
3.6.3 Khảo sát theo thời gian thực hiện phản ứng
Quá trình khảo sát sự phụ thuộc của tổng lƣợng muối thu đƣợc vào thời gian thực hiện phản ứng đƣợc tiến hành theo các bƣớc tƣơng tự nhƣ trên.
Để tìm ra điều kiện phản ứng tốt nhất, ta cố định một số thông số sau: Thể tích axit là 150ml và nhiệt độ phản ứng là 800C. Thay đổi thời gian thực hiện phản ứng lần lƣợt là: 5 phút, 7 phút, 9 phút, 12 phút, 15 phút.
Kết quả khảo sát yếu tố thời gian thực hiện chuyển hóa ảnh hƣởng đến tổng lƣợng muối thu đƣợc thể hiện qua bảng 3.8 và đồ thị hình 3.12
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát sự phụ thuộc tổng lƣợng muối thu đƣợc vào thời gian thực hiện chuyển hóa
STT Khối lƣợng mẫu (g) Lƣợng axit (g) Thời gian (phút) Lƣợng muối theo lý thuyết (g) Lƣợng muối theo thực tế (g) Hiệu suất (%) 1 200,298 5,146 5 5,962 2,444 40,993 2 200,930 5,162 7 5,981 3,120 52,155 3 200,348 5,147 9 5,964 2,961 49,648 4 200,207 5,143 12 5,959 2,860 47,995 5 200,478 5,150 15 5,967 2,511 42,081 0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 50 60 70 80 90 (g) Nhiệt độ (0 C)
Hình 3.12: Đồ thị sự phụ thuộc tổng lƣợng muối thu đƣợc vào thời gian
Nhận xét:
Muối magiê hydroxycitrat tổng hợp từ axit hydroxycitric đạt khối lƣợng lớn nhất là 3,120g đạt hiệu suất 52,155% ở thể tích 150ml, nhiệt độ 800C và thời gian thực hiện chuyển hóa là 7 phút.
3.7 XÁC ĐỊNH CẤU TRÖC CỦA MUỐI MAGIÊ HYDROXYCITRAT BẰNG PHỔ HỒNG NGOẠI
Hình 3.13: Phổ IR của muối canxi hydroxycitrat chuẩn
Lƣợng muối (g) Thời gian (phút) 0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 5 7 9 12 15
Hình 3.14: Phổ IR của muối magiê hydroxycitrat tổng hợp đƣợc
Nhận xét:
So sánh phổ IR của muối magiê hydroxycitrat đã tổng hợp đƣợc (hình 3.14) với muối canxi hydroxycitrat chuẩn (hình 3.13). Kết quả cho thấy xuất hiện các pic lần lƣợt có bƣớc sóng 3398,59 cm-1
; 3400,11 cm-1 ứng với phổ dao động của nhóm –OH và có pic ứng với bƣớc sóng 1604,94 cm-1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
; 1599,04 cm-1 ứng với nhóm C=O trong nhóm (-COO)2Mg và (-COO)2Ca. Về hình dáng, ta thấy các pic hầu nhƣ trùng nhau. Tuy nhiên, phổ của muối tổng hợp đƣợc có xuất hiện các pic phụ nhỏ là do muối tổng hợp đƣợc vẫn còn tạp chất.
3.8 XÁC ĐỊNH CẤU TRÖC CỦA MUỐI MAGIÊ HYDROXYCITRAT BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC
Hình 3.15: Sắc kí đồ muối magiê hydroxycitrat chuẩn
Hình 3.16: Sắc ký đồ muối magiê hydroxycitrat tổng hợp đƣợc
Nhận xét:
Kết quả đo HPLC cho thấy muối magiê hydroxycitrat đã tổng hợp (hình 3.15) đƣợc có thời gian lƣu là 4,10 phút. Theo mẫu HPLC của muối chuẩn có thời gian lƣu là: 4,005 phút (theo công bố của Shrivastava và các cộng sự) (hình 3.16). Điều này chứng tỏ việc thực hiện chuyển hóa từ axit hydroxycitric sang muối mgiê hydroxycitrat đã thành công. HYDR OXYC ITRI C AC ID M AGNE SIUM 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 RetentionTime(min) 0 2 4 6 8 10 12 Intensit y (mV) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Retention Time (min)
0 5 10 15 20 25 Intensity (mV) STD 4 .0 0 5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Retention Time (min)
0 5 10 15 20 25 Intensity (mV) STD 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
Retention Time (min) 0 5 10 15 20 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Retention Time (min)
0 5 10 15 20 25 Intensity (mV) STD 4 .0 0 5
3.9 XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG KIM LOẠI NẶNG TRONG SẢN PHẨM MUỐI THU ĐƢỢC
Để sản phẩm muối magiê đƣợc ứng dụng làm thực phẩm chức năng thì ta phải xác định hàm lƣợng kim loại có trong sản phẩm muối bằng phƣơng pháp hấp thụ nguyên tử (AAS).
Bảng 3.9: Kết quả xác định thành phần kim loại nặng trong sản phẩm muối
STT Tên kim loại Phƣơng pháp thử (AAS) Kết quả (mg/kg)
Tiêu chuẩn CODEX STAN 164- 1989 16 (mg/kg) Hàm lƣợng cho phép (mg/kg) 1 Pb TCVN 6193-1996 0,0112 0,3 2 2 Cu TCVN 6193-1996 0,0033 5,0 30 3 Zn TCVN 6193-1996 0,0947 5,0 40 4 Fe TCVN 6177-1996 3,1500 15,0 x Nhận xét:
Kết quả xác định thành phần kim loại nặng trong sản phẩm muối magiê thấp hơn hàm lƣợng kim loại nặng cho phép trong lƣơng thực, thực phẩm quy định tại Quyết định số 867/1998/QĐ-BYT của Bộ Y Tế ngày 4 tháng 4 năm 1998 về việc ban hành Danh mục Tiêu chuẩn vệ sinh đối với lƣơng thực, thực phẩm 10. Vì vậy, có thể ứng dụng sản phẩm muối magiê hydroxycitrat làm thực phẩm chức năng và dƣợc phẩm trong lĩnh vực điều trị giảm cân.
KẾT LUẬN
Trong quá trình tiến hành nghiên cứu, đề tài đã đạt đƣợc một số kết quả cụ thể sau:
- Xác định đƣợc một số thông số lý- hóa: + Độ ẩm trung bình trong lá bứa là: 3,9%
+ Hàm lƣợng tro trung bình trong lá bứa: 3,28%
+ Các kim loại nặng trong lá bứa khô nằm trong giới hạn cho phép của tiêu chuẩn thực phẩm của Việt Nam và quốc tế.
- Đề tài đã xây dựng quy trình chiết tách axit trong lá bứa khô với dung môi là nƣớc. - Đã xác định đƣợc tổng lƣợng axit trong lá bứa khô bằng phƣơng pháp chuẩn độ là: 2,93%.
- Chứng minh đƣợc sự có mặt của axit HCA trong lá bứa bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã xác định đƣợc HCA là thành phần axit chủ yếu trong lá bứa, hàm lƣợng của HCA đƣợc tìm thấy là:2,569%
- Đã thực hiện đƣợc phản ứng chuyển hóa từ axit hydroxycitric thành muối magiê hydroxycitrat. Muối ở dạng bột mịn đƣợc rửa sạch nhiều lần với cồn và sấy khô ở 1000C trong vòng 48 giờ.
- Đã tìm đƣợc điều kiện chuyển hóa axit HCA thành muối magiê đạt hiệu suất là: + Thể tích axit: 150ml
+ Nhiệt độ chuyển hóa: 800 C + Thời gian chuyển hóa: 7 phút
- Kết quả xác định đƣợc hàm lƣợng một số kim loại nặng nằm trong khoảng cho phép có thể ứng dụng vào trong thực phẩm chức năng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt:
1. Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mặc (2002), Cở sở hóa học phân tích, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Bộ Y Tế- Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXBY học, Hà Nội
3. Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB y học, Hà Nội 4. Trần Hợp (2003), Tài nguyên cây gỗ Việt Nam, NXB nông nghiệp, Hà Nội 5. Từ Vọng Nghi (2001), Hóa học phân tích, NXB Đại học quốc gia, Hà Nội 6. Lê Thị Mùi (2008), Bài giảng phân tích công cụ, Đại học Đà Nẵng
7. Makoto Takagi (2006) ( Dịch giả: Trần Thị Ngọc Lan), Các phương pháp phân tích trong hóa học, NXB Kaguku- Dojin, Kyoto, Nhật Bản
8. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB y học, Hà Nội 9. Đặng Quang Vinh (2007), Nghiên cứu chiết tách và xác định hàm lượng axit
hydroxycitric trong lá, vỏ quả của cây bứa, Luận văn thạc sĩ khoa học hóa hữu cơ, Khoa hóa, Đại học Đà Nẵng.
10. Quyết định số 867/1998/QĐ- BYT của Bộ Y Tế ngày 4 tháng 4 năm 1998 về việc ban hành Danh mục Tiêu chuẩn vệ sinh đối với lƣơng thực, thực phẩm.
11. TCVN 4589-88: Đồ hộp- phƣơng pháp xác định hàm lƣợng axit tổng số và axit bay hơi
Tiếng Anh:
12. Jena BS, Jayaprakasha GK, Singh RP, Sakariah KK. (2002), “ Chemistry and biochemistry of (-)- hydroxycitric acid from Garcinia”, Journal of Agricultural and Food chemistry, 50(1), 10- 22
13. Lewis, Y. S.; Neelakantan, S. (1965), ”(-)- Hydroxycitric acid- The principal acid in the fruits of Garcinia cambogia “, Phytochemistry, 4,619- 625
14. Lewis, Y.S. (1969), “ Isolation and properties of hydroxycitric acid”, In Methods in Enzymology; Colowick, S. P., Kaplan, N. O., Eds.; Academic Press: New York, 13, 613-619
15. Codex Stan 164-1989: General Standard for fruit juices preserved exclusively by physical means not covered by individual standards (world- wide standard) Website:
16. http://www.dep.com.vn/modules.php?name=News&file=article&sid=418, “ Chiết