1.7.1 Giới thiệu chung về phƣơng pháp sắc ký
Sắc ký là một kỹ thuật vật lý và hóa lý để tách các chất trong một hỗn hợp. Cơ sở của sự tách sắc ký là các quá trình xảy ra ở trong cột tách khi mẫu đƣợc nạp vào. Ở đây, có sự tƣơng tác của chất phân tích với chất nhồi ở trong cột tách (pha tĩnh) theo các tính chất hóa lý nhất định nhƣ: sự hấp phụ, sự trao đổi, sự rây phân tử…
Quá trình sắc ký đƣợc thực hiện ở trong cột tách là giữa hai pha: pha tĩnh và pha động. Pha tĩnh nằm cố định trong cột tách. Pha động luôn chạy qua cột tách với một tốc độ nhất định và mang theo chất mẫu ra khỏi cột tách.
Bên cạnh sắc ký khí và sắc ký lỏng còn có sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy…
1.7.2.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng là quá trình tách hỗn hợp các chất ở trong cột tách sắc ký ở trạng thái lỏng. Vì thế các chất mẫu phân tích phải hòa tan trong một chất lỏng, thƣờng là pha động của quá trình sắc ký. Nó thích hợp cho cả các chất có nhiệt độ sôi cao lẫn chất có nhiệt độ thấp (trừ những chất ở điều kiện thƣờng là khí). Sắc ký lỏng có hai loại:
- Sắc ký lỏng áp suất thƣờng (cổ điển) - Sắc ký lỏng áp suất cao- HPLC
1.7.2.2.Pha tĩnh trong HPLC
Pha tĩnh trong HPLC cũng có 4 loại, tƣơng ứng với các loại sắc ký đó: - Hấp phụ pha thƣờng (NP-HPLC), hấp phụ pha ngƣợc (RP-HPLC) - Trao đổi ion (IE-HPLC)
- Phân bố- sắc ký chiết (P-HPLC) - Rây phân tử (GEL-HPLC)
Đều đƣợc chế tạo trên 3 chất nền là: silica, oxit nhôm và cao phân tử hữu cơ (polystyren). Nhƣng silica vẫn là chủ yếu (chiếm 30%) sau đó là nền oxit nhôm.
1.7.2.3.Pha động trong HPLC
Pha động trong HPLC tùy thuộc vào mỗi loại chất nhồi cột khác nhau. Nó có thể là một dung môi đơn, hỗn hợp của 2 hay 3 dung môi trộn với nhau theo tỉ lệ phù hợp. Song với bất kì loại sắc ký nào thì yêu cầu của dung môi làm pha động cũng thỏa mãn những yêu cầu nhất định sau:
- Phải trơ và không có tác dụng hóa học với pha tĩnh. - Bền và ổn định trong quá trình chạy sắc ký.
- Hòa tan tốt hỗn hợp chất mẫu.
- Phù hợp với loại detector đã chọn để phát hiện chất phân tích.
1.7.2.4.Phân tích định tính trong HPLC
Nguyên tắc của phân tích định tính theo HPLC:
Trong điều kiện sắc ký đã chọn, dùng các chất chuẩn để xác định thời gian lƣu của các chất phân tích theo sắc đồ bơm mẫu riêng của từng chất nhƣ thế ta lập đƣợc
thời gian lƣu của mỗi chất. Do đó, đến khi phân tích mẫu chƣa biết ta cũng bơm mẫu và ghi sắc đồ của mẫu phân tích và nếu có một chất có thời gian lƣu trùng với một trong các chất trong mẫu chuẩn thì kết luận có mặt chất đó trong mẫu cần phân tích.
1.7.2.5 Phân tích định lƣợng
Nguyên tắc của phân tích định lƣợng là dựa trên cơ sở trong một phạm vi nhất định của chất phân tích thì chiều cao hay diện tích pic của pic sắc ký là có quan hệ tỉ lệ thuận với nồng độ của nó ở trong mẫu.
H= k.C Hay S=k.C Trong đó: H: chiều cao của pic sắc ký S: diện tích của pic sắc ký
K: hằng số của các điều kiện thực nghiệm của quá trình sắc ký Vì thế, nguyên tắc của phƣơng pháp này là:
- Chuẩn bị một dãy mẫu chuẩn cùng với các mẫu phân tích trong cùng một điều kiện. - Chọn một quy trình phù hợp để chạy sắc ký dãy mẫu chuẩn và các mẫu phân tích. - Thử sắc đồ thu đƣợc, xác định giá trị H (hay S) của các chất phân tích trong các
mẫu và các mẫu phân tích tƣơng ứng
- Sau đó xây dựng đƣờng chuẩn H-C (hay S-C). Rồi từ các đƣờng chuẩn này chúng ta dễ dàng phát hiện đƣợc nồng độ của chất phân tích.
1.7.3. Một vài ứng ứng dụng của HPLC
Hiện nay, HPLC đƣợc áp dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Vì nó có nhiều ƣu việt hơn sắc ký cổ điển nhƣ:
- Độ nhạy cao, tốn ít mẫu, tốc độ phân tích lớn, nhanh chóng cho kết quả. - Khả năng tách đƣợc nhiều hỗn hợp chất.
Các lĩnh vực đã và đang sử dụng HPLC nhiều là:
- Công nghiệp hóa học, hóa dầu
- Công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, thuốc trừ sâu
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.1 Nguyên liệu
Lá bứa của cây bứa (hình 2.1) đƣợc hái tại phƣờng Hòa Hiệp Bắc, quận Liên Chiểu, thành phố Đà Nẵng.
Tên khoa học: Garcinia oblongifolia Champ.Ex Benth, thuộc họ măng cụt- Clusiaceae
Hình 2.1: Cây và lá bứa 2.1.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
Dụng cụ- thiết bị
- Máy đo IR, máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS (Trung tâm khí tƣợng thủy văn Trung Trung Bộ số 666- Trƣng Nữ Vƣơng- Đà Nẵng).
- Máy đo sắc ký lỏng hiệu năng cao (Trung tâm kĩ thuật tiêu chuẩn đo lƣờng chất lƣợng số 2- Ngô Quyền- Đà Nẵng)
- Tủ sấy, lò nung, cân phân tích, nồi áp suất, bếp điện, phễu hút chân không. - Bình tam giác, cốc thủy tinh, phễu lọc…
Hóa chất
- MgO, HNO3, fixanal NaOH 0,1N, than hoạt tính, cồn 960, cồn tuyệt đối…
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phƣơng pháp trọng lƣợng 2.2.1 Phƣơng pháp trọng lƣợng
- Xác định độ ẩm của nguyên liệu
- Xác định hàm lƣợng tro của nguyên liệu
2.2.2 Phƣơng pháp chƣng ninh
Ta chiết tách axit hữu cơ trong lá bứa bằng phƣơng pháp chƣng ninh trong nồi áp suất
- Lá bứa khô đƣợc cắt nhỏ và cho vào nồi áp suất cùng với 150ml nƣớc.
- Chƣng trong nồi áp suất trong thời gian 1 giờ và lặp lại 2 lần để chiết tách hết lƣợng axit hữu cơ có trong mẫu với dung môi là nƣớc.
2.2.3 Phƣơng pháp chuẩn độ axit- bazơ 11
Xác định tổng lƣợng axit trong lá bứa khô theo tiêu chuẩn TCVN 4589- 88: Nhỏ
NaOH 0,1N từ buret xuống, cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững. Độ axit toàn phần theo phần trăm (X) đƣợc tính theo công thức sau:
P V V n K X cd 100
Trong đó: n: Số ml NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ Vcd: thể tích mẫu cô đặc (ml)
P: Trọng lƣợng mẫu thử (gam)
V: thể tích mẫu sử dụng để chuẩn độ (ml) K: hệ số của các loại axit, K= 0,006904
2.2.4 Các phƣơng pháp hóa lý
Sử dụng các phƣơng pháp hóa lý sau:
- Phƣơng pháp đo phổ hồng ngoại IR: Để xác định phổ dao động của các nhóm chức có trong sản phẩm muối tạo thành.
- Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): để xác định các axit hữu cơ có
trong mẫu chiết và muối tổng hợp đƣợc từ dịch chiết.
- Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS): Để xác định hàm lƣợng các kim loại nặng nhƣ: Pb, Cu, Zn, Fe, Sn trong mẫu muối.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 3.1.1 Sơ đồ nghiên cứu 3.1.1 Sơ đồ nghiên cứu
3.1.2 Xử lý nguyên liệu 3.1.2.1 Nguyên liệu 3.1.2.1 Nguyên liệu
Lá đƣợc hái tại phƣờng Hòa Hiệp Bắc, quận Liên Chiểu, thành phố Đà Nẵng. Lá có màu xanh thẩm, hình bầu dục, nhọn ở đầu, dài từ 6- 10cm (hình 3.1), có vị chua đặc trƣng. Không chọn những lá quá già.
3.1.2.2 Làm sạch nguyên liệu
Lá thu về cần loại bỏ những lá quá già, lá quá non, lá úa vàng. Tiếp theo, ta làm sạch lớp bụi bẩn bám trên bề mặt lá bằng cách cho lá vào chậu nƣớc lớn, ngâm trong vài phút, dùng tay khuấy đều và chà xát lá để bụi bẩn trên lá trôi hết. Cuối cùng, lá đƣợc vớt ra một cái rổ đựng có lỗ để cho ráo nƣớc. Tiến hành rửa 3- 4 lần để lá đƣợc sạch hoàn toàn. - Làm sạch - Cắt nhỏ - Sấy khô Lá bứa tƣơi Lá bứa khô Dịch chiết axit Tổng hợp muối magiê của HCA
Đo HPLC
- Theo thể tích - Theo thời gian - Theo nhiệt độ - Độ ẩm - Hàm lƣợng tro Khảo sát Thành phần kim loại các yếu tố Xác định lƣợng axit Chuẩn độ Chƣng ninh - Hàm lƣợng kim loại nặng - Đo IR
Lá sau khi rửa còn đọng rất nhiều nƣớc nên ta cần phải làm ráo nƣớc. Sau khi lƣợng nƣớc trên bề mặt lá đã giảm bớt, ta để lá khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Trong quá trình hong khô, ta thƣờng xuyên dùng tay xới lá để lá đƣợc khô hoàn toàn. Sau khi lá đã đƣợc hong khô, ta dùng kéo hoặc dao để cắt nhỏ lá (hình 3.2) và bảo quản lá ở nơi khô ráo thoáng mát.
Hình 3.1: Lá bứa tƣơi Hình 3.2: Lá bứa khô cắt nhỏ 3.2 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ LÝ- HÓA
3.2.1 Xác định độ ẩm
Dụng cụ, thiết bị: Cốc thủy tinh, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích Tiến hành:
Cân khoảng 10g lá bứa khô cắt nhỏ cho vào cốc thủy tinh đã đƣợc làm sạch, sấy khô và biết khối lƣợng chính xác. Cho cốc có chứa mẫu lá vào tủ sấy và sấy ở 800
C. Quá trình sấy đƣợc thực hiện trong 3 giờ. Sau khi kết thúc, ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc đƣợc nguội hoàn toàn thì tiến hành cân khối lƣợng trên cân phân tích.
Cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần liên tiếp là không đổi hoặc có sai số trong phạm vi cho phép thì dừng tiến hành.Ta có thể xác định độ ẩm của mẫu lá dựa vào công thức sau:
100 0 1 m m m H o
Trong đó: m0 : Khối lƣợng lá bứa trƣớc khi sấy (g) m1 : Khối lƣợng lá bứa sau khi sấy (g) H : Độ ẩm (%)
Bảng 3.1: Kết quả xác định độ ẩm trong lá bứa STT Khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy m0(g) Khối lƣợng mẫu sau khi sấy m1 (g) Khối lƣợng nƣớc trong mẫu m0- m1 (g) Độ ẩm H (%) 1 10,029 9,650 0,379 3,779 2 10,063 9,651 0,409 4,064 3 10,060 8,795 0,388 3,856 Nhận xét:
Độ ẩm trung bình trong lá bứa khô khoảng 3,9%. Độ ẩm trong lá bứa tƣơng đối thấp. Ở độ ẩm này nguyên liệu trong quá trình bảo quản không bị mốc hỏng.
3.2.2 Xác định hàm lƣợng tro trong lá
Dụng cụ, thiết bị: Chén sứ, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích.
Tiến hành:
Cân khoảng 4g lá đã đƣợc sấy khô cho vào chén sứ đã biết chính xác khối lƣợng. Cho chén sứ chứa mẫu vào lò nung và nung ở 8000C. Quá trình nung khoảng 6 giờ.
Khi thấy mẫu đã đƣợc tro hóa gần nhƣ hoàn toàn. Lúc này tro có màu trắng, bột mịn. Nếu mẫu không có màu trắng thì nhỏ vài giọt HNO3 rồi tiếp tục nung đến khi xuất hiện màu trắng.
Khi nung xong, dùng kẹp lấy chén ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi nguội hoàn toàn thì tiến hành cân khối lƣợng trên cân phân tích.
Cứ sau khoảng 30 phút ta lại tiến hành một lần cho đến khi khối lƣợng giữa 2 lần liên tiếp nhau không đổi hoặc sai số nằm trong khoảng cho phép thì ngừng. Hàm lƣợng tro trong lá bứa khô đƣợc xác định theo công thức sau:
100
0
1
m
m
H
Trong đó: m1: Khối lƣợng tro (g)
m0: Khối lƣợng lá bứa khô trƣớc khi tro hóa (g)
Bảng 3.2: Kết quả xác định tỉ lệ tro trong lá bứa STT Khối lƣợng cốc (g) Khối lƣợng mẫu+cốc (g) Khối lƣợng mẫu (g) Khối lƣợng mẫu+cốc sau khi
tro hóa (g) Khối lƣợng tro (g) Tỷ lệ tro (%) 1 47,717 52,003 4,286 47,855 0,138 3,220 2 48,452 52,850 4,398 48,601 0,149 3,388 3 59,301 63,614 4,313 59,441 0,140 3,246 Nhận xét:
Hàm lƣợng tro trung bình trong lá bứa sấy khô là 3,285%. Hàm lƣợng tro trong lá bứa thấp, chiếm khoảng 3,3% khối lƣợng lá.
3.2.3 Xác định thành phần kim loại nặng
Cân chính xác từ 1- 1,5g mẫu, cho vào chén sứ, thêm vào 2,5ml dung dịch HNO3 đậm đặc, ngâm trong vòng 24 giờ.Lấy ra chƣng cách thủy cho đến khi mẫu khô và chuyển sang màu trắng, trƣờng hợp mẫu khô nhƣng chƣa xuất hiện màu trắng ta thêm 3-5ml nƣớc cất và tiếp tục đun cách thủy cho đến mẫu khô và có màu trắng.Để nguội chén, đem định mức thành 500ml bằng nƣớc cất. Sau đó, ta tiến hành đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS để xác định một số hàm lƣợng kim loại nặng chủ yếu trong lá bứa khô. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả xác định thành phần kim loại trong lá bứa khô
STT Tên kim loại Phƣơng pháp thử (AAS) Kết quả (mg/kg)
Tiêu chuẩn CODEX STAN 164- 1989 17 (mg/kg) Hàm lƣợng cho phép (mg/kg) 1 Pb TCVN 6193-1996 0,1283 0,3 2 2 Cu TCVN 6193-1996 0,6991 5,0 30 3 Zn TCVN 6193-1996 2,2651 5,0 40 4 Fe TCVN 6177-1996 0,777 15,0 - 5 Sn TCVN 6193-1996 0,0061 200,0 40 7 Tổng Cu, Fe và Zn 3,7412 20,0
Nhận xét:
Thành phần kim loại nặng trong lá bứa thấp, kết quả so sánh với tiêu chuẩn CODEX STAN 164- 1989 17, tiêu chuẩn và chất lƣợng trái cây và hàm lƣợng kim loại nặng cho phép trong các loại rau quả quy định tại Quyết định số 867/1998/QĐ- BYT của Bộ Y Tế ngày 4 tháng 4 năm 1998 về việc ban hành Danh mục Tiêu chuẩn vệ sinh đối với lƣơng thực, thực phẩm 10, thì các kim loại nặng nằm trong giới hạn cho phép, có thể sử dụng lá bứa để làm thực phẩm hoặc dƣợc phẩm mà không ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời.
3.3 CHƢNG NINH BẰNG NỒI ÁP SUẤT ĐỂ THU ĐƢỢC DỊCH CHIẾT AXIT
Dịch chiết axit đƣợc chiết bằng phƣơng pháp chƣng ninh trong nồi áp suất: Cân khoảng 10g lá khô đã đƣợc cắt nhỏ, cho vào nồi áp suất và thêm khoảng 150ml nƣớc cất. Thực hiện chƣng ninh trong nồi áp suất ở nhiệt độ 1270C, áp suất 0,15 Mpa trong vòng 1giờ. Lấy cốc tiến hành lọc bằng vải muslin và thu đƣợc dịch chiết axit , phần bã thực hiện chiết lặp lại thêm vài lần nữa cho đến khi bã không còn vị chua bằng cách thử với giấy pH cho môi trƣờng trung tính. Dịch chiết thu đƣợc có màu đỏ nâu (hình 3.3). Trộn lẫn dịch chiết các lần với 4 gam than hoạt tính và ngâm trong nƣớc ấm trong vòng 30 phút, sau đó lọc hút chân không dùng phễu buchne, than hoạt tính đƣợc rửa lại 2 lần với nƣớc cất, mỗi lần rửa 10ml để thu hồi hết axit. Dịch chiết sau khi đƣợc tẩy màu với than hoạt tính đã mất màu hoàn toàn (hình 3.3). Trộn lẫn dịch lọc và rửa, cô đặc đến 100ml, xử lý với 100ml cồn 960, để yên trong 15 phút để kết tủa pectin (màu trắng sữa) (hình 3.5). Lọc hoặc ly tâm để loại bỏ hoàn toàn kết tủa pectin. Phần kết tủa đƣợc rửa lại 2 lần với cồn 960, mỗi lần rửa 10ml để thu hồi toàn bộ lƣợng axit trong dịch chiết. Trộn lẫn các dịch nổi lại với nhau, cô đặc đến 100ml (hình 3.4) và lƣu trong tủ lạnh. Kiểm tra dịch chiết bằng phƣơng pháp chuẩn độ axit- bazơ và HPLC.
Hình 3.3: Dịch chiết trƣớc và sau khi tẩy màu
Hình 3.4 Dịch chiết sau khi cô đặc Hình 3.5: Kết tủa pectin
3.4 KIỂM TRA DỊCH CHIẾT BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ VÀ HPLC 3.4.1 Xác định tổng lƣợng axit trong dịch chiết bằng phƣơng pháp chuẩn độ 3.4.1 Xác định tổng lƣợng axit trong dịch chiết bằng phƣơng pháp chuẩn độ
Kết quả xác định tổng lƣợng axit trong dịch chiết bằng phƣơng pháp chuẩn độ đƣợc trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4: Kết quả xác định tổng lƣợng axit trong lá bứa khô
Nhận xét:
Tổng lƣợng axit chuẩn độ đƣợc trong dịch chiết của lá bứa khô là: 2,93%. So sánh
