2.2.1 Phƣơng pháp trọng lƣợng
- Xác định độ ẩm của nguyên liệu
- Xác định hàm lƣợng tro của nguyên liệu
2.2.2 Phƣơng pháp chƣng ninh
Ta chiết tách axit hữu cơ trong lá bứa bằng phƣơng pháp chƣng ninh trong nồi áp suất
- Lá bứa khô đƣợc cắt nhỏ và cho vào nồi áp suất cùng với 150ml nƣớc.
- Chƣng trong nồi áp suất trong thời gian 1 giờ và lặp lại 2 lần để chiết tách hết lƣợng axit hữu cơ có trong mẫu với dung môi là nƣớc.
2.2.3 Phƣơng pháp chuẩn độ axit- bazơ 11
Xác định tổng lƣợng axit trong lá bứa khô theo tiêu chuẩn TCVN 4589- 88: Nhỏ
NaOH 0,1N từ buret xuống, cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững. Độ axit toàn phần theo phần trăm (X) đƣợc tính theo công thức sau:
P V V n K X cd 100
Trong đó: n: Số ml NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ Vcd: thể tích mẫu cô đặc (ml)
P: Trọng lƣợng mẫu thử (gam)
V: thể tích mẫu sử dụng để chuẩn độ (ml) K: hệ số của các loại axit, K= 0,006904
2.2.4 Các phƣơng pháp hóa lý
Sử dụng các phƣơng pháp hóa lý sau:
- Phƣơng pháp đo phổ hồng ngoại IR: Để xác định phổ dao động của các nhóm chức có trong sản phẩm muối tạo thành.
- Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): để xác định các axit hữu cơ có trong mẫu chiết và muối tổng hợp đƣợc từ dịch chiết.
- Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS): Để xác định hàm lƣợng các kim loại nặng nhƣ: Pb, Cu, Zn, Fe, Sn trong mẫu muối.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 3.1.1 Sơ đồ nghiên cứu 3.1.1 Sơ đồ nghiên cứu
3.1.2 Xử lý nguyên liệu 3.1.2.1 Nguyên liệu 3.1.2.1 Nguyên liệu
Lá đƣợc hái tại phƣờng Hòa Hiệp Bắc, quận Liên Chiểu, thành phố Đà Nẵng. Lá có màu xanh thẩm, hình bầu dục, nhọn ở đầu, dài từ 6- 10cm (hình 3.1), có vị chua đặc trƣng. Không chọn những lá quá già.
3.1.2.2 Làm sạch nguyên liệu
Lá thu về cần loại bỏ những lá quá già, lá quá non, lá úa vàng. Tiếp theo, ta làm sạch lớp bụi bẩn bám trên bề mặt lá bằng cách cho lá vào chậu nƣớc lớn, ngâm trong vài phút, dùng tay khuấy đều và chà xát lá để bụi bẩn trên lá trôi hết. Cuối cùng, lá đƣợc vớt ra một cái rổ đựng có lỗ để cho ráo nƣớc. Tiến hành rửa 3- 4 lần để lá đƣợc sạch hoàn toàn. - Làm sạch - Cắt nhỏ - Sấy khô Lá bứa tƣơi Lá bứa khô Dịch chiết axit Tổng hợp muối magiê của HCA
Đo HPLC
- Theo thể tích - Theo thời gian - Theo nhiệt độ - Độ ẩm - Hàm lƣợng tro Khảo sát Thành phần kim loại các yếu tố Xác định lƣợng axit Chuẩn độ Chƣng ninh - Hàm lƣợng kim loại nặng - Đo IR
Lá sau khi rửa còn đọng rất nhiều nƣớc nên ta cần phải làm ráo nƣớc. Sau khi lƣợng nƣớc trên bề mặt lá đã giảm bớt, ta để lá khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Trong quá trình hong khô, ta thƣờng xuyên dùng tay xới lá để lá đƣợc khô hoàn toàn. Sau khi lá đã đƣợc hong khô, ta dùng kéo hoặc dao để cắt nhỏ lá (hình 3.2) và bảo quản lá ở nơi khô ráo thoáng mát.
Hình 3.1: Lá bứa tƣơi Hình 3.2: Lá bứa khô cắt nhỏ 3.2 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ LÝ- HÓA
3.2.1 Xác định độ ẩm
Dụng cụ, thiết bị: Cốc thủy tinh, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích Tiến hành:
Cân khoảng 10g lá bứa khô cắt nhỏ cho vào cốc thủy tinh đã đƣợc làm sạch, sấy khô và biết khối lƣợng chính xác. Cho cốc có chứa mẫu lá vào tủ sấy và sấy ở 800
C. Quá trình sấy đƣợc thực hiện trong 3 giờ. Sau khi kết thúc, ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc đƣợc nguội hoàn toàn thì tiến hành cân khối lƣợng trên cân phân tích.
Cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần liên tiếp là không đổi hoặc có sai số trong phạm vi cho phép thì dừng tiến hành.Ta có thể xác định độ ẩm của mẫu lá dựa vào công thức sau:
100 0 1 m m m H o
Trong đó: m0 : Khối lƣợng lá bứa trƣớc khi sấy (g) m1 : Khối lƣợng lá bứa sau khi sấy (g) H : Độ ẩm (%)
Bảng 3.1: Kết quả xác định độ ẩm trong lá bứa STT Khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy m0(g) Khối lƣợng mẫu sau khi sấy m1 (g) Khối lƣợng nƣớc trong mẫu m0- m1 (g) Độ ẩm H (%) 1 10,029 9,650 0,379 3,779 2 10,063 9,651 0,409 4,064 3 10,060 8,795 0,388 3,856 Nhận xét:
Độ ẩm trung bình trong lá bứa khô khoảng 3,9%. Độ ẩm trong lá bứa tƣơng đối thấp. Ở độ ẩm này nguyên liệu trong quá trình bảo quản không bị mốc hỏng.
3.2.2 Xác định hàm lƣợng tro trong lá
Dụng cụ, thiết bị: Chén sứ, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích.
Tiến hành:
Cân khoảng 4g lá đã đƣợc sấy khô cho vào chén sứ đã biết chính xác khối lƣợng. Cho chén sứ chứa mẫu vào lò nung và nung ở 8000C. Quá trình nung khoảng 6 giờ.
Khi thấy mẫu đã đƣợc tro hóa gần nhƣ hoàn toàn. Lúc này tro có màu trắng, bột mịn. Nếu mẫu không có màu trắng thì nhỏ vài giọt HNO3 rồi tiếp tục nung đến khi xuất hiện màu trắng.
Khi nung xong, dùng kẹp lấy chén ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi nguội hoàn toàn thì tiến hành cân khối lƣợng trên cân phân tích.
Cứ sau khoảng 30 phút ta lại tiến hành một lần cho đến khi khối lƣợng giữa 2 lần liên tiếp nhau không đổi hoặc sai số nằm trong khoảng cho phép thì ngừng. Hàm lƣợng tro trong lá bứa khô đƣợc xác định theo công thức sau:
100 0 1 m m H
Trong đó: m1: Khối lƣợng tro (g)
m0: Khối lƣợng lá bứa khô trƣớc khi tro hóa (g)
Bảng 3.2: Kết quả xác định tỉ lệ tro trong lá bứa STT Khối lƣợng cốc (g) Khối lƣợng mẫu+cốc (g) Khối lƣợng mẫu (g) Khối lƣợng mẫu+cốc sau khi
tro hóa (g) Khối lƣợng tro (g) Tỷ lệ tro (%) 1 47,717 52,003 4,286 47,855 0,138 3,220 2 48,452 52,850 4,398 48,601 0,149 3,388 3 59,301 63,614 4,313 59,441 0,140 3,246 Nhận xét:
Hàm lƣợng tro trung bình trong lá bứa sấy khô là 3,285%. Hàm lƣợng tro trong lá bứa thấp, chiếm khoảng 3,3% khối lƣợng lá.
3.2.3 Xác định thành phần kim loại nặng
Cân chính xác từ 1- 1,5g mẫu, cho vào chén sứ, thêm vào 2,5ml dung dịch HNO3 đậm đặc, ngâm trong vòng 24 giờ.Lấy ra chƣng cách thủy cho đến khi mẫu khô và chuyển sang màu trắng, trƣờng hợp mẫu khô nhƣng chƣa xuất hiện màu trắng ta thêm 3-5ml nƣớc cất và tiếp tục đun cách thủy cho đến mẫu khô và có màu trắng.Để nguội chén, đem định mức thành 500ml bằng nƣớc cất. Sau đó, ta tiến hành đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS để xác định một số hàm lƣợng kim loại nặng chủ yếu trong lá bứa khô. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả xác định thành phần kim loại trong lá bứa khô
STT Tên kim loại Phƣơng pháp thử (AAS) Kết quả (mg/kg)
Tiêu chuẩn CODEX STAN 164- 1989 17 (mg/kg) Hàm lƣợng cho phép (mg/kg) 1 Pb TCVN 6193-1996 0,1283 0,3 2 2 Cu TCVN 6193-1996 0,6991 5,0 30 3 Zn TCVN 6193-1996 2,2651 5,0 40 4 Fe TCVN 6177-1996 0,777 15,0 - 5 Sn TCVN 6193-1996 0,0061 200,0 40 7 Tổng Cu, Fe và Zn 3,7412 20,0
Nhận xét:
Thành phần kim loại nặng trong lá bứa thấp, kết quả so sánh với tiêu chuẩn CODEX STAN 164- 1989 17, tiêu chuẩn và chất lƣợng trái cây và hàm lƣợng kim loại nặng cho phép trong các loại rau quả quy định tại Quyết định số 867/1998/QĐ- BYT của Bộ Y Tế ngày 4 tháng 4 năm 1998 về việc ban hành Danh mục Tiêu chuẩn vệ sinh đối với lƣơng thực, thực phẩm 10, thì các kim loại nặng nằm trong giới hạn cho phép, có thể sử dụng lá bứa để làm thực phẩm hoặc dƣợc phẩm mà không ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời.
3.3 CHƢNG NINH BẰNG NỒI ÁP SUẤT ĐỂ THU ĐƢỢC DỊCH CHIẾT AXIT
Dịch chiết axit đƣợc chiết bằng phƣơng pháp chƣng ninh trong nồi áp suất: Cân khoảng 10g lá khô đã đƣợc cắt nhỏ, cho vào nồi áp suất và thêm khoảng 150ml nƣớc cất. Thực hiện chƣng ninh trong nồi áp suất ở nhiệt độ 1270C, áp suất 0,15 Mpa trong vòng 1giờ. Lấy cốc tiến hành lọc bằng vải muslin và thu đƣợc dịch chiết axit , phần bã thực hiện chiết lặp lại thêm vài lần nữa cho đến khi bã không còn vị chua bằng cách thử với giấy pH cho môi trƣờng trung tính. Dịch chiết thu đƣợc có màu đỏ nâu (hình 3.3). Trộn lẫn dịch chiết các lần với 4 gam than hoạt tính và ngâm trong nƣớc ấm trong vòng 30 phút, sau đó lọc hút chân không dùng phễu buchne, than hoạt tính đƣợc rửa lại 2 lần với nƣớc cất, mỗi lần rửa 10ml để thu hồi hết axit. Dịch chiết sau khi đƣợc tẩy màu với than hoạt tính đã mất màu hoàn toàn (hình 3.3). Trộn lẫn dịch lọc và rửa, cô đặc đến 100ml, xử lý với 100ml cồn 960, để yên trong 15 phút để kết tủa pectin (màu trắng sữa) (hình 3.5). Lọc hoặc ly tâm để loại bỏ hoàn toàn kết tủa pectin. Phần kết tủa đƣợc rửa lại 2 lần với cồn 960, mỗi lần rửa 10ml để thu hồi toàn bộ lƣợng axit trong dịch chiết. Trộn lẫn các dịch nổi lại với nhau, cô đặc đến 100ml (hình 3.4) và lƣu trong tủ lạnh. Kiểm tra dịch chiết bằng phƣơng pháp chuẩn độ axit- bazơ và HPLC.
Hình 3.3: Dịch chiết trƣớc và sau khi tẩy màu
Hình 3.4 Dịch chiết sau khi cô đặc Hình 3.5: Kết tủa pectin
3.4 KIỂM TRA DỊCH CHIẾT BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ VÀ HPLC 3.4.1 Xác định tổng lƣợng axit trong dịch chiết bằng phƣơng pháp chuẩn độ 3.4.1 Xác định tổng lƣợng axit trong dịch chiết bằng phƣơng pháp chuẩn độ
Kết quả xác định tổng lƣợng axit trong dịch chiết bằng phƣơng pháp chuẩn độ đƣợc trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4: Kết quả xác định tổng lƣợng axit trong lá bứa khô
Nhận xét:
Tổng lƣợng axit chuẩn độ đƣợc trong dịch chiết của lá bứa khô là: 2,93%. So sánh với các loài đã nghiên cứu nhƣ: Garcinia Indica (5,88- 6,99%), Garcina Cowa (4,457%) thì kết quả chiết bằng nƣớc của lá bứa khô là thấp.
3.4.2 Xác định HCA trong mẫu chiết bằng phƣơng pháp HPLC
Phƣơng pháp chuẩn độ axit- bazơ đƣợc dùng để xác định tổng lƣợng các axit hữu cơ có mặt trong lá bứa khô. Tuy nhiên, phƣơng pháp này không giúp ta định lƣợng
Mẫu P (g) Vcd (ml) V (ml) n (ml) X (g/100g) X (g/100g)
1 10,535 100 10 4,4 2,88
2,93
2 10,547 100 10 4,9 3,21
đƣợc axit hydroxycitric (HCA) riêng biệt với các axit hữu cơ khác. Chính vì thế, ta lựa chọn phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lƣợng và định tính HCA. Bởi vì, phƣơng pháp này có ƣu điểm là không cần cô đặc, sấy hoặc hóa hơi mẫu trƣớc khi đo nhƣ sắc ký khí.
3.4.2.1. Xây dựng đƣờng chuẩn
Chất chuẩn: (-)-Calcium threo- hydroxycitrat tribasic hydrate
Đƣờng chuẩn đƣợc xác định bằng cách thay đổi nồng độ của 5 mẫu dung dịch chuẩn. Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng với nồng độ thay đổi từ 10ppm đến 320ppm, phƣơng trình đƣờng chuẩn là:
C=1,34A-6,88
Với: A: là diện tích pic của HCA
C: là nồng độ của HCA
Hệ số tƣơng quan R2= 0,999
Hình 3.6: Đồ thị đƣờng chuẩn của HCA 3.4.2.2. Kết quả xác định axit HCA trong lá bứa
HCA thu đƣợc dựa vào diện tích pic, bằng cách áp dụng hệ số pha loãng và sử dụng đƣờng chuẩn. Nồng độ của HCA trong mẫu đƣợc xác định công thức sau:
10000 % Mn Kpl Vdm Int Am SI HCA
Trong đó: SI: hệ số góc đƣờng chuẩn Int: hệ số b của đƣờng chuẩn
Am: diện tích pic sắc ký
Vđm: thể tích mẫu sau khi cô đặc sử dụng cho HPLC (ml) Kpl: hệ số pha loãng
Mn: khối lƣợng mẫu (g)
Từ đồ thị đƣờng chuẩn HCA (hình 3.6), ta xác định thành phần HCA bằng công thức cụ thể sau:
Cm%= (1,34*Am- 6,88)*Vđm*Kpl/10000*Mn Kết quả: đƣợc thể hiện trong bảng 3.5 sau đây:
Bảng 3.5: Kết quả xác định HCA trong lá bứa bằng HPLC
STT Mn (g) Am Vđm Kpl %HCA
1 10,535 85,112 100 25 2,543
2 10,547 87,348 100 25 2,611
3 10,496 85,102 100 25 2,552
Hình 3.7: Sắc ký đồ axit HCA chuẩn Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu lá bứa chiết trong nƣớc
Nhận xét
Axit tìm thấy chủ yếu trong lá bứa khô bằng phƣơng pháp HPLC là HCA, chiếm 2,569g/100g. Xác định pic HCA đƣợc dựa vào pic của axit HCA chuẩn (theo công bố của Đặng Quang Vinh 9) (hình 3.7) xuất hiện với thời gian lƣu là 4,939 phút. Thời
gian lƣu HCA tìm thấy trong dịch chiết là 5,058 phút đƣợc thể hiện trên sắc kí đồ (hình 3.8)
3.5 TỔNG HỢP MUỐI MAGIÊ HYDROXYCITRAT
Tiến hành
Dịch chiết axit thu đƣợc, sau khi tẩy màu bằng than hoạt tính và xử lý kết tủa pectin, đem cho tác dụng với bột MgO dƣ cho đến khi phản ứng xảy ra hoàn toàn. Lọc bỏ lƣợng MgO dƣ thu đƣợc dịch có màu vàng nâu.
Cho cồn 960
vào dịch vừa thu đƣợc sau phản ứng dùng đũa thủy tinh khuấy đều, thấy xuất hiện kết tủa dạng hạt nhỏ dẻo giống kẹo mạch nha lắng xuống đáy cốc. Để lắng tách bỏ phần dịch lọc thu đƣợc chất rắn có màu vàng nhạt (hình 3.9).
Cho cồn tuyệt đối vào cốc chứa chất rắn vừa thu đƣợc. Dùng muỗng chà mịn chất rắn thành bột mịn trong cồn tuyệt đối. Tách bỏ dịch lọc thu đƣợc chất rắn ở dạng bột mịn.
Chất rắn này đƣợc ngâm và rửa nhiều lần với cồn 960. Sau đó, ngâm trong cồn tuyệt đối qua đêm để làm sạch.
Cuối cùng, tách bỏ phần dịch thu chất rắn và cho phần chất rắn này vào tủ sấy khô ở nhiệt độ 1000C trong vòng 48 giờ, thu đƣợc muối magiê hydroxycitrat dạng bột mịn hơi vàng (hình 3.9). Đem cân khối lƣợng muối thu đƣợc. Tiến hành đo HPLC và một số kim loại nặng của muối thu đƣợc.
Hình 3.9: Muối magiê trƣớc và sau khi sấy
3.6 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN TỔNG LƢỢNG MUỐI THU ĐƢỢC
Dịch chiết axit thu đƣợc sau khi tẩy màu với than hoạt tính và xử lý kết tủa pectin, đem đi cô đặc đến các thể tích sau: 50ml, 100ml, 150ml, 200ml, 250ml
Cho dịch chiết tác dụng với MgO dƣ, đun nóng ở nhiệt độ 800
C trong vòng 5 phút. Đến khi phản ứng xảy ra hoàn toàn (pH=8-10), lọc bỏ MgO dƣ, thu đƣợc dịch có màu vàng nâu.
Cho cồn 960
vào dịch chiết vừa mới thu đƣợc, dùng đũa thủy tinh khuấy đều thấy xuất hiện kết tủa dạng hạt nhỏ dẻo nhƣ kẹo mạch nha lắng xuống đáy cốc. Để lắng, tách bỏ dịch chiết thu đƣợc chất rắn có màu vàng nhạt.
Cho cồn tuyệt đối vào cốc chứa chất rắn thu đƣợc, dùng muỗng chà mịn chất rắn trong cồn tuyệt đối. Tách bỏ dịch lọc thu đƣợc chất rắn ở dạng bột mịn.
Chất rắn này đƣợc ngâm và rửa nhiều lần với cồn 960
. Sau đó ngâm chất rắn vào cồn tuyệt đối qua đêm để làm sạch.
Cuối cùng, tách bỏ phần dịch thu đƣợc chất rắn, cho chất rắn này vào tủ sấy khô ở nhiệt độ 1000C, trong vòng 48 giờ, thu đƣợc muối magiê hidroxycitrat bột mịn hơi vàng. Cân khối lƣợng muối vừa thu đƣợc và tính hiệu suất của phản ứng.
Kết quả khảo sát yếu tố thể tích axit ảnh hƣởng đến tổng lƣợng muối thu đƣợc đƣợc thể hiện qua bảng 3.6 và đồ thị hình 3.10
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát sự phụ thuộc tổng lƣợng muối thu đƣợc vào thể tích axit STT Khối lƣợng mẫu (g) Lƣợng axit (g) Thể tích axit (ml) Lƣợng muối theo lý thuyết (g)