1. Cấy trữ mẫu
Sau khi đã phân lập và kiểm tra độ ròng của các dòng vi khuẩn, tiến hành trữ mẫu nhƣ sau: Chọn khuẩn lạc rời cấy trữ trong ống nghiệm có chứa mơi trƣờng Pseudomonas isolation agar (4%) có bổ sung glycerol (2%), bảo quản
trong tủ lạnh ở 4-50C, thời gian bảo quản từ 2-3 tháng.
2. Nuôi nhân mật số vi khuẩn
- Tiến hành cấy mẫu vi khuẩn trữ trong ống nghiệm ra đĩa pêtri có mơi trƣờng Pseudomonas isolation agar.
- Đặt đĩa pêtri đã cấy vi khuẩn vào tủ ủ vi sinh ở nhiệt độ 320
C trong 48 giờ để vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc rời.
- Pha môi trƣờng minimal với thành phần nhƣ bảng 1. - Cho 3ml môi trƣờng minimal vào ống nghiệm.
- Chủng vi khuẩn vào ống nghiệm có chứa mơi trƣờng minimal. Sau đó đặt ống nghiệm đã chủng vi khuẩn lên máy lắc, lắc trong 48-72 giờ.
- Sau 48-72 giờ tiến hành đếm mật số vi khuẩn bằng buồng đếm hồng cầu. Mật số vi khuẩn phải đạt từ 106
-109 tế bào/ml (Theo TCVN 6169 -1996)
3. Thí nghiệm trồng lúa
3.1. Thí nghiệm trồng lúa trong ống nghiệm với mơi trƣờng khống đặc
Thí nghiệm này nhằm chọn ra những dịng vi khuẩn có hiệu quả cao đối với cây lúa trồng trong ống nghiệm để tiếp tục thí nghiệm đối với cây lúa trồng trong chậu.
Các bƣớc tiến hành thí nghiệm
Chọn 20 dịng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH4+
cao dựa vào kết quả đo khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn ( đã thực hiện trong đề tài cấp trƣờng “ Phân lập vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa ở Cần Thơ và xác định
- Nuôi vi khuẩn trong môi trƣờng minimal để tăng sinh khối đến mật số 108
tế bào/ml.
- Khử trùng lúa giống bằng oxy già và cồn 700
. - Ủ lúa trong môi trƣờng agar 2% đến khi nảy mầm.
- Chủng vi khuẩn đã đạt mật số vào lúa đã nảy mầm, để yên trong 3-6 giờ. - Gieo lúa vào các ống nghiệm đã có mơi trƣờng khống 0,8% agar và đặt
các ống nghiệm này ngồi ánh sáng tự nhiên.
Chăm sóc
- Nhỏ nƣớc vào ống nghiệm trồng lúa nếu thấy môi trƣờng khô.
- Khi cây con ra một lá thật, chọn giữ lại 1 cây khoẻ mạnh để theo dõi khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn theo các nghiệm thức đã bố trí hồn tồn ngẫu nhiên.
- Sau 15 ngày theo dõi chọn ra khoảng 10 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và kết hợp tốt với cây lúa, để tiến hành thí nghiệm trong chậu đất.
a) Hình 3: Ủ lúa và chủng vi khuẩn b)
Bảng 4: Kết quả đo NH4+
Stt Mẫu Ngày thứ 3 Ngày thứ 6 Ngày thứ 8 Giá trị OD Lƣợng đạm(mg/l) Giá trị OD Lƣợng đạm(mg/l) Giá trị OD Lƣợng đạm(mg/l) 1 PĐ3 0,822 24,347 0,023 0,663 0.003 0,113 2 CĐ4 0,233 5,731 0,213 5,467 0,006 0,363 3 NK3 0,194 4,851 0,231 5,913 0,191 5,546 4 TN2 0,19 4,761 0,229 5,864 0,002 0,110 5 BT2 0,158 4,038 0,042 1,223 0,013 0,200 6 CĐ1 0,138 3,587 0,073 1,993 0,004 0,279 7 CĐ3 0,136 3,542 0,106 2,811 0,005 0,025 8 NK2 0,235 5,777 0,159 4,127 0,009 0,420 9 CR3 0,123 3,605 0,086 2,321 0,003 0,025 10 CR4 1,272 37,700 0,169 4,505 0,004 0,048 11 PĐ2 0,071 2,074 0,003 0,107 0,007 0,003 12 CĐ2 0,123 3,248 0,024 0,777 0,004 0,054 13 OM1 0,025 1,036 0,002 0,231 0,015 0,256 14 OM2 0,02 0,923 0,01 0,067 0,002 0,110 15 CR2 0,002 0,427 0,004 0,082 0,004 1,430 16 NK4 0,024 1,014 0,015 0,553 0,038 1,237 17 BT3 0,024 1,014 0,002 0,231 0,005 0,307 18 TN4 0,004 0,381 0,002 0,231 0,002 0,212 19 TN5 0,003 0,404 0,003 0,256 0,001 0,194 20 OM6 0,001 0,449 0,123 1,479 0,008 0,059 21 Đchứng 0,056 1,617 0,054 0,181 0,06 0,054
3.2. Thí nghiệm trồng lúa trong chậu đất
Thí nghiệm đánh giá khả năng cố định đạm của 10 dòng vi khuẩn trên cây lúa cao sản trồng trong chậu tại nhà lƣới Khoa Khoa Học Tự Nhiên- trƣờng Đại Học Cần Thơ.
Bố trí thí nghiệm:
Các dịng vi khuẩn đƣợc bố trí gồm 12 nghiệm thức đƣợc lặp lại 2 lần với vi khuẩn cố định đạm khác nhau khơng bổ sung thêm đạm hóa học. Mỗi chậu trồng 3 cây lúa (giống lúa cao sản nhƣ nhau cho mỗi chậu, kích thƣớc chậu 15x20 cm) đặt trong nhà lƣới.
Số đơn vị thí nghiệm là 12 x 2 = 24
Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị đất trồng
Đất đƣợc lấy tại ruộng lúa thuộc tỉnh Hậu Giang, làm nhuyễn, cân 3kg cho vào mỗi chậu. Cho nƣớc vào các chậu có chứa đất, ngâm trong 72 giờ, sau đó chắc nƣớc ra. Tiến hành bón lót bằng phân lân kết hợp với vôi để hạ phèn.
Chuẩn bị lúa giống
- Sử dụng giống lúa OM 4218 để gieo.
- Lúa giống đã đƣợc loại bỏ các hạt lép, kém chất lƣợng, dùng oxy già và cồn 700
để khử trùng lúa. Sau khi khử trùng lúa xong, ủ lúa trên môi trƣờng agar 2% để lúa nảy mầm.
- Chủng các dòng vi khuẩn đã tăng mật số lên lúa đã nảy mầm, trộn đều để yên trong 3-6 giờ.
- Gieo lúa đã chủng vi khuẩn vào chậu đất đã xử lý. Mỗi chậu gieo 10 hạt. Sau khi lúa lên đƣợc 1 tuần tiến hành tuyển chọn giữ lại mỗi chậu 3 cây.
Chăm sóc lúa trồng trong chậu Bón phân theo tỉ lệ sau
Bảng 5: Tỉ lệ bón phân cho lúa
Các thời kì bón phân N P K Bón lót (trƣớc khi gieo) - 50% - Bón thúc lần 1 (7-10 NSG) 30% - 30% Bón thúc lần 2 (10-18 NSG) 40% 50% 35% Bón thúc lần 3 (40-45 NSG) 30% - 35%
Cơng thức bón phân: 90N – 80P – 50K cho 1ha, cho tồn vụ lúa (Cơng ty phân bón Miền Nam)
- Điều chỉnh mức nƣớc trong chậu phù hợp với từng giai đoạn phát triển của cây lúa:
Đối với cây lúa sau khi gieo một tuần thì giữ mức nƣớc cách ngọn lúa 5cm.
Đối với cây lúa sau khi gieo đƣợc 15 ngày trở lên thì giữ mức nƣớc cách miệng chậu 2cm.
- Phòng trừ sâu bệnh và các sinh vật gây hại bằng phƣơng pháp quản lý dịch hại tổng hợp (IPM).
3.2.1. Các chỉ tiêu thành phần năng suất lúa
So màu lá lúa
- Thực hiện 2 lần trƣớc khi bón phân đợt 2, đợt 3. - Thời gian so màu lúc 8 - 9 giờ sáng
- Đánh giá nhu cầu đạm của cây lúa dựa vào thang màu của bảng so màu lá lúa.
Chiều dài rễ
- Thu mẫu ở giai đoạn 35 ngày sau sạ. - Rửa sạch, đặt trong khai có giấy thấm.
- Đo từ gốc thân đến cuối chóp rễ dài nhất. Đo mỗi bụi/ mỗi lần lặp lại sau đó tính trung bình cho mỗi nghiệm thức.
Chiều cao cây
Đo từ mặt đất đến lá cao nhất của cây ở các nghiệm thức trong các giai đoạn 21, 28, 35 sau sạ.
Trọng lƣợng khô của cây
- Thu mẫu ở giai đoạn 35 ngày sau sạ. - Sấy khô ở nhiệt độ 700
C trong 4 ngày, cân sinh khối sau đó tính trung bình trọng lƣợng khô 2 cây của 2 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức.
Số chồi/ bụi
Đếm số chồi trong từng giai đoạn để đánh giá khả năng đẻ nhánh ở mỗi nghiệm thức.
Bảng 6: Bố trí thí nghiệm
Nghiệm thức Vi khuẩn cố định đạm (vkN) Ký hiệu nghiệm thức NT+ Không chủng vi khuẩn, 0vkN +N bón đạm hố học NT- Không chủng vi khuẩn, 0vkN +0N khơng bón đạm hố học NT1 Chủng vi khuẩn 1 vkN1 NT2 Chủng vi khuẩn 2 vkN2 NT3 Chủng vi khuẩn 3 vkN3 NT4 Chủng vi khuẩn 4 vkN4 NT5 Chủng vi khuẩn 5 vkN5 NT6 Chủng vi khuẩn 6 vkN6 NT7 Chủng vi khuẩn 7 vkN7 NT8 Chủng vi khuẩn 8 vkN8 NT9 Chủng vi khuẩn 9 vkN9 NT10 Chủng vi khuẩn 10 vkN10
Tóm tắt q trình thí nghiệm
Trồng lúa trong nhà lƣới để khảo sát khả năng cố định đạm của 10 dòng vi khuẩn.
Chọn ra dịng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao nhất.
Trồng lúa trong mơi trƣờng khống đặc để khảo sát khả năng cố định đạm của 20 dịng vi khuẩn.
Chọn ra 10 dịng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao.
Chọn 20 dịng vi khuẩn có khả năng cố đinh đạm cao dựa vào kết quả đo NH4+
của vi khuẩn đã phân lập đƣợc (đề tài phân lập vi
khuẩn từ đất vùng rễ lúa ở Cần Thơ và xác định các dịng có khả năng cố định đạm).
Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Thí nghiệm trồng lúa trong ống nghiệm với mơi trƣờng khống đặc
- Chiều cao trung bình của cây lúa ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn trồng trong ống nghiệm khác biệt so với đối chứng dƣơng và đối chứng âm. Chiều cao trung bình của cây lúa ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn dao động từ 18,58 – 28,95 cm cao hơn so với đối chứng âm 10,39% -72,01%. Mặt khác giữa các nghiệm thức chủng vi khuẩn khác nhau cũng có sự khác biệt về chiều cao.
- Trọng lƣợng khơ trung bình của cây lúa ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn dao động từ 0,15- 0,19g cao hơn so với đối chứng âm 7,14%-35,7%.
- Thơng qua các chỉ số chiều cao trung bình và trọng lƣợng khơ trung bình của cây lúa ở các nghiệm thức cho thấy các dòng vi khuẩn TN2, CR4, NK2, BT2, CR3, CĐ3, CĐ4, PĐ3, NK3, CĐ1 có ảnh hƣởng tốt đến cây lúa
(bảng 7). Đây là những dịng vi khuẩn có ảnh hƣởng tốt đến cây lúa trồng trong ống nghiệm.
Việc chủng vi khuẩn cố định đạm vào cây lúa có ảnh hƣởng tích cực đến sự phát triển chiều cao và trọng lƣợng khô của cây lúa trồng trong ống nghiệm.
Bảng 7: Đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn lên cây lúa trồng trong ống nghiệm 30 ngày
Stt Nghiệm thức Chiều cao cây lúa (cm) Trọng lƣợng khô (g) 1 Đối chứng dƣơng 34,33 a 0,20 2 Đối chứng âm 16,83 c 0,14 3 BT2 27,17 a b c 0,19 4 CĐ2 24,25 a b c 0,16 5 TN4 21,90 b c 0,15 6 CR2 22,73 a b c 0,16 7 PĐ3 27,42 b c 0,18 8 CĐ1 27.75 a b c 0,16 9 CR3 26,00 b c 0,18 10 NK3 28,95 a b 0,17 11 BT3 21,00 a b c 0,16 12 PĐ2 18,58 a b c 0,16 13 CR4 23,33 b c 0,18 14 OM6 21,12 a b c 0,15 15 CĐ3 21,58 b c 0,17 16 OM2 18,90 a b c 0,16 17 TN2 27,50 b c 0,17 18 CĐ4 25,00 a b c 0,16 19 OM1 20,00 b c 0,15 20 TN5 20,50 b c 0,15 21 NK2 26,00 a b c 0,16 22 NK4 22,50 b c 0,16
Bảng 8: 10 dịng vi khuẩn đƣợc chọn thí nghiệm trong nhà lƣới Stt Dịng vi khuẩn 1 BT2 2 CR3 3 NK3 4 CR4 5 TN2 6 CĐ3 7 PĐ3 8 NK2 9 CĐ1 10 CĐ4
2. Thí nghiệm trồng lúa trong chậu đất
Mục đích của thí nghiệm này nhằm đánh giá hiệu quả của 10 dịng vi khuẩn đã chọn lên đặc tính sinh trƣởng của cây lúa trồng trong chậu.
Bảng 9: Thí nghiệm trồng lúa trong chậu
Nghiệm thức (NT) Dòng vi khuẩn Ký hiệu Đối chứng dƣơng Khơng chủng vi khuẩn 0vk +100N
Bón 100% đạm
Đối chứng âm Không chủng vi khuẩn 0vk +0N Khơng bón đạm NT1 BT2 vkBT2 NT2 CR3 vkCR3 NT3 NK3 vkNK3 NT4 CR4 vkCR4 NT5 TN2 vkTN2 NT6 CĐ3 vkCĐ3 NT7 PĐ3 vkPĐ3 NT8 NK2 vkNK2 NT9 CĐ1 vkCĐ1 NT10 CĐ4 vkCĐ4
Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn cố định đạm lên các chỉ tiêu của cây lúa trồng trong chậu
A. Ảnh hƣởng lên chỉ tiêu chiều cao
- Ở giai đoạn cây lúa đƣợc 21 ngày sau khi gieo (NSKG) thì chiều cao của cây lúa ở các nghiệm thức không thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê. Nhƣ vậy ở giai đoạn này chƣa thấy rõ ảnh hƣởng của việc chủng vi khuẩn và khơng chủng vi khuẩn, bón và khơng bón đạm lên chiều cao của cây lúa.
- Đến giai đoạn 28 NSKG, cây lúa ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn đều có chiều cao cây khơng khác biệt thống kê với đối chứng dƣơng nhƣng khác biệt với đối chứng âm trừ nghiệm thức 5. Chiều cao cây lúa ở nghiệm thức chủng vi khuẩn thấp hơn đối chứng dƣơng 0,38 -3% và cao hơn so với đối chứng âm 3 -12,7%.
- Đặc biệt cây lúa ở các NT2 (dòng vi khuẩn CR3), NT3 (dòng vi khuẩn NK3), NT4 (dịng vi khuẩn CR4) có chiều cao khơng khác biệt so với đối chứng dƣơng, nhƣng rất khác biệt so đối chứng âm ở mức ý nghĩa 5%. Chiều cao của cây lúa ở ba nghiệm thức này dao động từ 54,48– 56,22 cm cao hơn so với đối chứng âm 9,2% - 12,7%.
- Giai đoạn 35 NSKG, chiều cao trung bình của cây lúa ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn không khác biệt so với đối chứng dƣơng nhƣng khác biệt với đối cứng âm trừ nghiệm thức 5 và nghiệm thức 10. Chiều cao cây lúa ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn thấp hơn so với đối chứng dƣơng 0,7 - 8% và cao hơn so với đối chứng âm 2,95 -11%. Đặc biệt chiều cao trung bình của cây lúa ở các NT2 (dòng vi khuẩn CR3), NT3 (dòng vi khuẩn NK3), NT4 (dòng vi khuẩn CR4) vƣợt trội hơn hẳn các nghiệm thức chủng vi khuẩn khác và cao hơn so với đối chứng âm 8-11%.
- Giai đoạn 28 NSKG và 35 NSKG, chiều cao trung bình của cây lúa giữa các nghiệm thức chủng vi khuẩn khác nhau cũng có sự chênh lệch rõ rệt. Điều này chứng tỏ mỗi dịng vi khuẩn có ảnh hƣởng khác nhau đến sự tăng trƣởng chiều cao của cây lúa. Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Quốc Nam (2009).
Giống nhƣ thí nghiệm trên lúa mì của Kapulnik và ctv (1981, 1983), chiều cao của cây lúa trong thí nghiệm này tăng lên qua các lần thu chỉ tiêu.Ta thấy ở các nghiệm thức: NT2, NT3, NT4, và đối chứng dƣơng có chiều cao cây khác biệt nhau khơng có ý nghĩa thống kê trong các giai đoạn sinh trƣởng nhƣng rất khác biệt so với đối chứng âm.
Các chỉ số về chiều cao cho thấy trong quá trình sinh trƣởng của cây lúa trồng trong chậu nếu khơng bón đạm hoặc khơng chủng vi khuẩn cố định đạm thì sẽ làm ảnh hƣởng khơng tốt đến sự tăng trƣởng về chiều cao của cây lúa.
Bảng 10: Chỉ số chiều cao của lúa trong nhà lƣới
Nghiệm thức Chiều cao
21 NSG 28 NSG 35 NSG Đối chứng dƣơng 43,92 a 56,48 a 65,95 a Đối chứng âm 40,83 a b 49,85 b c 58,93 a b NT1 41,57 a b 51,33 a b 61,78 a b NT2 43,38 a 54,83 a b 63,93 a NT3 42,28 a b 56,22 a b 65,43 a NT4 43,03 a 54,48 a b 63,67 a NT5 38,65 b 47,32 c 50,33 c NT6 42,03 a b 52,60 a b c 62,78 a NT7 42,05 a b 53,23 a b c 62,10 a b NT8 41,05 a b 52,95 a b c 60,67 a b NT9 41,50 a b 53,02 a b c 62,52 a NT10 40,67 a b 51,33 a b c 54,25 b c
B. Ảnh hƣởng lên chỉ tiêu số lƣợng chồi
- Ở giai đoạn 21 NSKG, số chồi của cây lúa ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn không khác với nghiệm thức đối chứng dƣơng nhƣng có sự khác biệt so với nghiệm thức đối chứng âm, kết quả này tƣơng tự với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quốc Nam khi khảo sát sự nảy chồi của cây lúa có chủng vi khuẩn khơng bón phân ở giai đoạn 21, 27 NSG. Cây lúa ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn có số chồi trung bình dao động từ 2,5 -3,17 ít hơn so với đối chứng dƣơng 12,8 -31,8% nhƣng số lƣợng chồi nhiều hơn so với đối chứng âm 25 -58,5%.
- Cây lúa ở NT2 (dòng vi khuẩn CR3), NT3 (dòng vi khuẩn NK3), NT4 (dịng vi khuẩn CR4) có số lƣợng chồi nhiều hơn so với số lƣợng chồi của cây lúa ở các nghiệm thức có chủng vi khuẩn khác. Đồng thời số lƣợng chồi lúa ở ba nghiệm thức trên nhiều hơn 51,5 -58,5% so với đối chứng âm.
- Giai đoạn 28 NSKG, tất cả cây lúa ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn có
số lƣợng chồi nhiều hơn so với giai đoạn 21 NSKG và có sự khác biệt so với đối chứng âm.
- Trong đó nghiệm thức có chủng các dịng vi khuẩn CR3, NK3, CR4 thì số lƣợng chồi của cây lúa nhiều hơn 40,2 – 50,1 % so với số lƣợng chồi ở