II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số
Mỗi giống cam lấy 3 cây ựại diện, lấy lá bánh tẻ. ADN tổng số ựược tách chiết theo phương pháp của Cheng và cs (2003) [14].
Các bước tiến hành:
1. Nghiền 1.5 Ờ 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày và cối sứ.
2. Chuyển bột này sang ống falcon 15 ml, sau ựó bổ sung 6 ml ựệm chiết CTAB (ựã ựược làm nóng ựến 650C).
3. đảo ựều và ủ mẫu ở 650C trong thời gian 60 phút, 10 phút ựảo ựều một lần.
4. Làm lạnh ựến nhiệt ựộ phòng. Bổ sung 4 ml Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), ựảo ựều trong 10 phút.
5. Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt ựộ phòng.
6. Sau ựó chuyển dịch trong phắa trên ống falcon sang một ống mới (4 ml). Bổ sung một thể tắch tương ựương (4 ml) Isopropanol, ựảo ựều, giữ ở nhiệt ựộ - 200C trong 30 phút.
7. Tủa ADN bởi máy ly tâm với tốc ựộ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Rửa tủa 2 - 3 lần (2 - 3h) mỗi lần với 1 ml Ethanol 70%.
8. Làm khô tủa ở nhiệt ựộ phòng. Thêm 2 ml ựệm TE và 15 ộl RNase A (10 mg/ml). Ủ ở 37oC trong 3h.
9. Chuyển dung dịch ADN vào một ống mới. Thêm 2 ml phenol- chloroform- isoamyl alcohol (25:24:1), ựảo ựều trong 5 - 10 phút và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút.
10. Chuyển phần dịch phắa trên vào ống mới. Thêm 750 ộl NaCl 5M và 3 ml Ete bão hòa hơi nước. Trộn ựều và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút. 11. Loại bỏ lớp Ete bên trên. Cẩn thận chuyển phần bên dưới vào ống mới 12. Thêm 3 ml isopropanol, trộn ựều và làm lạnh ở -20ồC trong 30 phút. Lấy
ADN ra bằng ựầu pipet hoặc ựũa thủy tinh. 13. Rửa tủa 3 lần với 1.5 ml ethanol 70%.
14. Làm khô tủa ở nhiệt ựộ phòng. Thêm 800 ộl ựệm TE ựể hòa tan tủa. 15. Giữ dung dịch ADN ở - 20ồC.
2.2.2. Thành phần của một phản ứng PCR
Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần ựược trình bày ở bảng 4.
Bảng 4: Thành phần của một phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tắch (ộl)
1 Nước cất hai lần khử ion 6.2
2 đệm PCR 10X 1.5
3 MgCl2 25mM 1.2
4 dNTPs 10mM 0.3
5 Taq ADN polymerase 5U/ộl 0.3
6 Mồi xuôi 10ộM 1.5
7 Mồi ngược 10ộM 1.5
8 ADN 2.5
2.2.3. Chương trình chạy PCR
Phản ứng PCR ựược tiến hành trong ống eppendorf 0.5 ml và thực hiện trên máy Mastercycler epgradient S theo chu trình sau (bảng 5).
Bảng 5: Chu trình của phản ứng PCR
Các bước Nhiệt ựộ(0C) Thời gian
1 94 5 phút 2 94 40 giây 3 55-60 30 giây 4 72 30 giây - 1 phút 5 Lặp lại từ bước 2, 35 lần 6 72 5 phút 7 4 ∞
Sau khi hoàn thành chương trình chạy PCR, sản phẩm PCR ựược bổ sung 4 ộl ADN Sequencing Stop Solution (Bao gồm: 10 mM NaOH + 95% formamide + 0.05% Bromophenol + 0.05% Xylene cyanol).
2.2.4. Biến tắnh sản phẩm PCR
Các sản phẩm PCR và các marker có trọng lượng chuẩn (ΦX174 ADN/HinfI, 0.5 ộg/ộl) và GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low, 0.5 ộg/ộl) ựược biến tắnh ở 950C trong 5 phút, sau ựó ngay lập tức làm lạnh và giữ trong ựá cho ựến khi ựược tra vào bản gel. (Biến tắnh trước khi tra vào bản gel khoảng 10 phút).
2.2.5. điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR sau khi biến tắnh ựược ựiện di trên gel polyacrylamide biến tắnh với các bước chuẩn bị như sau:
- Chuẩn bị kắnh:
+ Kắnh ngắn ựược lau sạch bằng nước cất 3 lần, lau lại bằng ethanol 95% 3 lần, xử lý chống dắnh bằng dung dịch Sigma Cote sau ựó loại bỏ Sigma Cote dư thừa bằng lau ethanol 95% hai lần.
+ Kắnh dài ựược lau sạch bằng nước cất 3 lần, lau lại bằng ethanol 95% 3 lần, rồi xử lý dắnh bằng Bind Silane (bổ sung 2 ộl Bind Silane vào 1ml dung dịch có chứa 95% ethanol + 5% glacial acetic acid), sau ựó lau lại kắnh bằng ethanol 95% hai lần.
- Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau (bản gel có kắch thước 38cm x 50cm):
+ Dung dịch acrylamide 4.5%: 90ml + Dung dịch APS 10%: 900ộl + Dung dịch TEMED: 90ộl
Trộn ựều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kắnh.
- Sau 1-2 giờ gel ựược polyme hoá hoàn toàn. Lắp ráp máy ựiện di, tiến hành tiền ựiện di ở công suất 100W, 2000V cho ựến khi nhiệt ựộ trên gel ựạt ựến 550C thì dừng lại và bắt ựầu tra sản phẩm PCR ựã ựược biến tắnh vào các giếng. Tiếp tục ựiện di với công suất 85W, 1750V, nhiệt ựộ trên gel là 500C - 550C trong thời gian 55- 60 phút.
2.2.6. Phương pháp nhuộm bạc ựối với gel polyacrylamide
Chuẩn bị các dung dịch:
- Dung dịch cố ựịnh/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): Glacial acetic
acid 10% ựược pha trước khi nhuộm.
- Dung dịch nhuộm (staining solution): hoà tan 1.5g AgNO3 trong 1.5 lắt nước cất hai lần khử ion sau ựó bổ sung 2.25 ml dung dịch formaldehyde 37%.
- Dung dịch biểu hiện (developing solution): hoà tan 45 g Na2CO3 trong 1.5 lắt nước cất hai lần khử ion, làm lạnh ở nhiệt ựộ - 200C trong khoảng thời gian 4h. Trước khi dùng, bổ sung 2.25ml dung dịch formaldehyde 37% + 300ộl sodium thiosulfate (10mg/ml).
Các bước tiến hành: (ựược ựặt trên máy lắc ngang với tốc ựộ 75
- Sau khi kết thúc thời gian ựiện di, cố ựịnh tấm kắnh bám gel bằng dung dịch cố ựịnh gel trong 20 phút (Dye ựã bị mất màu trên bản gel).
- Lấy bản gel ra khỏi dung dịch cố ựịnh, rửa bằng nước cất hai lần, mỗi lần trong 5 phút.
- Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong thời gian 30 phút.
- Rửa nhanh bản gel bằng nước cất hai lần trong thời gian 5-10 giây. - đưa gel vào dung dịch biểu hiện cho ựến khi các băng xuất hiện sau ựó ựổ trực tiếp dung dịch cố ựịnh (ựã dùng ở trên) lên trên bản gel ựể dừng phản ứng hiện, duy trì trong 6 -10 phút (khi mất các bọt khắ).
- Rửa lại bản gel bằng nước cất. để khô bản gel ở nhiệt ựộ phòng.
2.2.7. Phương pháp phân tắch số liệu
để xác ựịnh quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu, các kết quả thu ựược từ quá trình ựiện di, sản phẩm PCR ựược thành lập dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN.
- Số 1: các alen có xuất hiện băng ADN; - Số 0: các alen không xuất hiện băng ADN;
- Số 9: các dòng không xuất hiện băng ADN ở tất cả các alen (khuyết số liệu); Các số liệu trên ựược nhập vào phần mềm Exel lần lượt theo từng mồi. - Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) ựược tắnh theo công thức sau: PIC=1- ΣPi2 (trong ựó Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i)
Sau ựó, số liệu ựược chuyển sang chương trình NTSYSpc 2.02 ựể phân tắch, tìm ra hệ số tương ựồng di truyền (I) (theo Jaccard) và thành lập cây quan hệ chủng loại. Khoảng cách di truyền (D) ựược tắnh theo công thức:
D = 1 - I (Theo Jaccard, trắch dẫn theo Lanza L.L.B. et al, 1997) [40].
- Tỷ lệ dị hợp tử (H%) của mỗi dòng ựược tắnh theo công thức:
Y M X H − = %
Trong ựó: X: là tổng số mồi có xuất hiện 2 alen/1 locus SSR M: là tổng số mồi ựược sử dụng trong nghiên cứu
Y: là tổng số mồi SSR có xuất hiện băng ADN
- Tắnh tỷ lệ số mồi không xuất hiện băng ADN (M%) bằng công thức:
M Z M%=
Trong ựó: Z là tổng số mồi không xuất hiện băng ADN M là tổng số mồi ựược sử dụng trong nghiên cứu
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ
Tách chiết ADN là công việc ựầu tiên ựóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu sinh học phân tử. Hiện nay có rất nhiều phương pháp tách chiết ADN tổng số của mẫu thực vật. Ở nhóm cây có múi thì quy trình tách chiết ADN tổng số ựược tiến hành theo nhiều protocol khác nhau như của Webb và Knapp (1990) [63], Fang và cs (1997) [18], Cheng và cs (2003) [14]..vv. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn phương pháp tách chiết ADN theo phương pháp của Cheng và cs (2003) [14] có cải tiến. Kết quả tách chiết ADN tổng số ựược kiểm tra bằng phương pháp ựiện di trên gel agarose 0,8 % (Hình 1).
Hình 1: Kết quả kiểm tra ADN tổng số trên gel agarose của một số mẫu cam nghiên cứu
Qua kết quả ựiện di trên gel agarose 0.8% cho thấy các băng ADN thu ựược của các mẫu cây có múi khá gọn và ựồng ựều chứng tỏ chất lượng ADN của các mẫu là khá tốt, không bị ựứt gãy. Mặt khác không thấy xuất hiện vệt sáng RNA phắa dưới, ựiều ựó chứng tỏ RNA cũng ựã ựược loại bỏ khỏi dịch chiết ADN. Kết quả ựiện di cũng cho thấy ADN có nồng ựộ tương ựối cao, chất lượng tốt ựủ tiêu chuẩn thực hiện các bước tiếp theo.
3.2. đÁNH GIÁ đA DẠNG DI TRUYỀN TẬP đOÀN CAM VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ SSR BẰNG CHỈ THỊ SSR
để nghiên cứu mức ựộ ựa hình di truyền của tập ựoàn cam Việt Nam chúng tôi ựã sử dụng sản phẩm ADN tách chiết ở trên làm khuôn cho phản ứng PCR lần lượt với các mồi (bảng 4 và 5) cho mỗi tập ựoàn nghiên cứu.
Sản phẩm PCR của từng mồi ựược ựiện di trên gel polyacrylamide 4.5% và ựược phát hiện bằng phương pháp nhuộm bạc.
3.2.1. Hệ số PIC, số alen và tổng số băng ADN thể hiện trên từng mồi
Bảng 6: Hệ số PIC, số alen và tổng số băng ADN của từng mồi
TT Locus Số alen thể hiện/ mồi Tổng số băng ADN/mồi PIC 1 Ci02B10 2 48 0,49 2 Ci02F07 4 77 0,58 3 Ci06A05b 6 77 0,73 4 Ci07C09 4 71 0,57 5 Ci07G07 4 50 0,35 6 mCrCIR06A02 7 63 0,69 7 mCrCIR06B04 3 48 0,34 8 P94 3 84 0,65 9 P620 3 80 0,60 10 P1223 5 82 0,75 11 CAC23 2 47 0,41 12 NTCP9 3 46 0,65 13 AC01 3 50 0,24 14 AG14 4 49 0,60 15 CAT01 8 80 0,80 16 CT02 3 46 0,45 17 CT21 2 49 0,50 18 CTT01 4 60 0,60 19 GT03 6 96 0,64 Tổng 76 1230 10,64 Trung bình 4 63.32 0,56
Theo Smith & cs (1997) [58], hệ số PIC (Polymorphic Information Content) ựược coi là thước ựo tắnh ựa dạng di truyền của các alen ở từng locus SSR. Weir (1996) cho rằng, giá trị PIC có thể ựược hiểu như là sự ựa dạng di truyền của locus gen nghiên cứu.
Kết quả nghiên cứu với các giống cam chỉ ra ở bảng 6 cho thấy: giá trị PIC của 19 marker trong các mẫu giống cam nghiên cứu thay ựổi từ 0,24 (ở mồi AC01 với 3 alen ựược thể hiện) ựến 0.80 (ở mồi CAT01 với 8 alen thể hiện). Kết quả ở bảng 6 cũng cho thấy hệ số PIC của cả tập ựoàn có giá trị trung bình là 0,56.
Phân tắch 19 mồi SSR với 48 mẫu thuộc 16 giống cam thu ựược tổng số 76 loại alen, trung bình 4 alen/locus. Tất cả các mồi ựều ựa hình, trong ựó có 3 mồi cho 2 alen (Ci02B10, CAC23, CT21); 6 mồi thu ựược 3 alen (mCrCIR06B04, P94, P620, NTCP9, AC01, CT02); 5 mồi thu ựược 4 alen (Ci02F07, Ci07C09, Ci07G07, AG14, CTT01); 1 mồi thu ựược 5 alen (P1223); 2 mồi thu ựược 6 alen (Ci06A05b, GT03); 1 mồi thu ựược 7 alen (mCrCIR06A02) và 1 mồi thu ựược 8 alen (CAT01) (bảng 6).
3.2.2. Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) và tỉ lệ dị hợp (H%) của các mẫu giống cam nghiên cứu cam nghiên cứu
Tỷ lệ khuyết số liệu phản ảnh khả năng bắt cặp của các mẫu giống với các mồi nghiên cứu. Tỷ lệ khuyết số liệu lớn nhất ở mẫu VC3- Cam Vân Canh là 26,32%, và mẫu SBT2 Ờ Sành Bến Tre là 21,05%, trong số 48 mẫu thuộc 18 giống nghiên cứu thì 16 mẫu không khuyết số liệu ở tất cả các mồi nghiên cứu.
Tỷ lệ dị hợp ở mức locus (H%) cao nhất là 56,3% ở mẫu CS3 (mẫu thuộc giống cam Soàn). Có 8 mẫu có mức dị hợp cao hơn 50 % gồm: XD1, XD2, XD3, BH1, CC1, SBT1, CS1 và CS2; các mẫu thuộc 5 giống khác nhau.
Bảng 7: Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) và tỉ lệ dị hợp (H%) của các giống cam dựa trên kết quả phân tắch 28 locus khác nhau
TT Kắ hiệu Tên giống M% H% TT Kắ hiệu Tên giống M% H%
1 VD1 Cam Vân Du 5,26 38,9 25 CP1 Cam sành Cao
Phong 0,00 47,4 2 VD2 Cam Vân Du 5,26 33,3 26 CP2 Cam sành Cao Phong 0,00 47,4 3 VD3 Cam Vân Du 5,26 38,9 27 CP3 Cam sành Cao
Phong 5,26 44,4 4 SC1 Cam Sông
con 5,26 38,9 28 LV1 Cam Lòng Vàng 0,00 42,1 5 SC2 Cam Sông con 5,26 38,9 29 LV2 Cam Lòng Vàng 0,00 42,1 6 SC3 Cam Sông
con 5,26 44,4 30 LV3 Cam Lòng Vàng 0,00 42,1 7 VC1 Cam Vân
Canh 10,53 35,3 31 CC1 Cam Chanh 0,00 52,6 8 VC2 Cam Vân
Canh 5,26 33,3 32 CC2 Cam Chanh 0,00 36,8 9 VC3 Cam Vân
Canh 26,32 28,6 33 CC3 Cam Chanh 5,26 38,9 10 STQ1 Cam Sành
Tuyên Quang 5,26 27,8 34 SYB1
Cam Sành Văn
Chấn 5,26 38,9 11 STQ2 Cam Sành
Tuyên Quang 10,53 35,3 35 SYB2
Cam Sành Văn
Chấn 5,26 44,4 12 STQ3 Cam Sành
Tuyên Quang 5,26 33,3 36 SYB3
Cam Sành Văn
Chấn 0,00 47,4 13 QT1 Cam Sành
Quang Thuận 15,79 43,8 37 SBT1 Cam sành Bến Tre 15,79 50 14 QT2 Cam Sành
Quang Thuận 15,79 25 38 SBT2 Cam sành Bến Tre 21,05 40 15 QT3 Cam Sành
Quang Thuận 0,00 36,8 39 SBT3 Cam sành Bến Tre 0,00 47,4 16 XD1 Cam Xã đoài 0,00 52,6 40 CS1 Cam Soàn 5,26 55,6 17 XD2 Cam Xã đoài 5,26 50 41 CS2 Cam Soàn 15,79 56,3 18 XD3 Cam Xã đoài 0,00 52,6 42 CS3 Cam Soàn 5,26 33,3 19 BH1 Cam Bố Hạ 5,26 55,6 43 MCH 1 Cam mật có hạt 15,79 37,5 20 BH2 Cam Bố Hạ 15,79 37,5 44 MCH 2 Cam mật có hạt 15,79 37,5 21 BH3 Cam Bố Hạ 5,26 44,4 45 MCH 3 Cam mật có hạt 5,26 44,4 22 CG1 Cam Giấy 0,00 36,8 46 MKH1 Cam mật không hạt 0,00 47,4 23 CG2 Cam Giấy 0,00 36,8 47 MKH
2 Cam mật không hạt 0,00 42,1 24 CG3 Cam Giấy 5,26 33,3 48 MKH
Các mẫu khác có mức dị hợp dao ựộng từ 25% ựến 50% nhưng không có giống nào có cả 3 mẫu ựều có mức dị hợp giống nhau. điều này chứng tỏ có sự sai khác giữa các mẫu thuộc cùng một giống và giữa các giống; các giống có sự ựa dạng về mức ựộ dị hợp, và không có nhiều sự khác biệt về mức dị hợp giữa các giống thuộc tập ựoàn cam thu tại miền bắc và các tập ựoàn cam Miền Nam. Như vậy, phân tắch với 35 locus thì tỷ lệ dị hợp chung của cả tập ựoàn là khá cao, không có mẫu nào ựồng hợp cả 35 locus nghiên cứu. Kết quả trên cũng cho thấy giữa các giống với nhau có sự khác nhau về mức ựộ dị hợp; các mẫu trong cùng một giống cũng có sự khác nhau ở các locus nghiên cứu. Những kết quả này rất hữu ắch ựể so sánh giữa các giống với nhau, nghiên cứu ựa dạng di truyền bên trong giống và nhận dạng chắnh xác những dòng (cá thể ưu việt) trong tập ựoàn.
3.2.3. Kết quả phân tắch mối quan hệ di truyền của tập ựoàn cam nghiên cứu cứu
Số liệu thu ựược từ 19 mồi SSR ựược thống kê và phân tắch bằng phần mềm NTSYSpc2.1, từ ựó thiết lập ựược bảng hệ số tương ựồng di truyền (bảng 8) và sơ ựồ cây phát sinh chủng loại của các mẫu cam (hình 4).
Qua kết quả bảng 8 và hình 4 cho thấy: hệ số tương ựồng di truyền của 48 mẫu cam dao ựộng từ 0.08 ựến 1. Cặp mẫu (QT1 Ờ BH2) có sự sai khác di truyền lớn nhất (Hệ số tương ựồng lần lượt là 0,08). điều này chứng tỏ mẫu QT1 và BH2 có sự sai khác rất lớn về mặt di truyền. Một số cặp và nhóm mẫu trong cùng một giống nên có kiểu gen tương tự nhau (hệ số tương ựồng là 1) như: các cặp mẫu SC1 Ờ SC2 thuộc giống cam Sông Con, LV2 Ờ LV3 thuộc giống cam Lòng Vàng, MCH1- MCH2 thuộc giống cam mật có hạt, CC2 Ờ CC3 thuộc giống cam chanh, CG1 Ờ CG2 thuộc giống cam giấy, STQ1 Ờ STQ2 thuộc giống cam sành Tuyên Quang, 3 mẫu
thuộc giống cam sành Yên Bái, ựặc biệt là mẫu MCH3 thuộc giống cam mật có hạt có kiểu gen tượng tự với kiểu gen của mẫu MKH2 thuộc giống cam mật có hạt ở cả 19 loccus nghiên cứu.
Ở mức tương ựồng di truyền 58%, 48 mẫu giống cam nghiên cứu ựược