• Nhuộm màu bề mặt bằng phương phỏp nhuộm Giemsa.
• Nhuộm tiờu bản vi thể bằng phương phỏp nhuộm Hematoxylin- Eosin ( H.E), nhuộm huỳnh quang.
• Nghiờn cứu siờu cấu trỳc qua cỏc tiờu bản hiển vi điện tử xuyờn và hiển vi điện tử quột.
• Nhuộm húa mụ miễn dịch để phỏt hiện K3 và K12.
34 • Lưu giữ hỡnh ảnh lõm sàng của bệnh nhõn bằng chụp ảnh kỹ thuật số và vẽ sơ đồ tổn thương giỏc mạc và BMNC. • Xử lý số liệu bằng chương trỡnh thống kờ y học Epi-Info 2000. 2.5. Địa điểm nghiờn cứu - Bộ mụn Mụ-Phụi, Trường Đại học Y Hà Nội - Bệnh viện Mắt Trung ương
35
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIấN CỨU
3.1.Xõy dựng qui trỡnh thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm nền nuụi cấy.
3.1.1. Lựa chọn màng ối
Làm tiờu bản vi thể những mảnh màng ối lấy ở cỏc vị trớ : trờn bề mặt bỏnh rau, 10 cm tớnh từ rỡa bỏnh rau, 15 cm tớnh từ rỡa bỏnh rau
3.1.1.1. Màng ối lấy trờn bề mặt bỏnh rau: Rất dày, biểu mụ phủ màng
ối là biểu mụ tầng gồm 3-4 hàng tế bào (Hỡnh 3.1). Sau khi xử lý bằng ammnium 10% và nạo bỏ biểu mụ, màng đỏy của màng ối dày, bề mặt sần sựi, độ chun gión rất kộm.
Hỡnh 3.1. Màng ối trờn bề mặt bỏnh rau (H.E x 250) 1. Biểu mụ 2. Màng đỏy
3.1.1.2. Màng ối lấy ở vựng 10 cm tớnh từ rỡa bỏnh rau:
Khi nhuộm bề mặt bằng giemsa, biểu mụ màng ối quan sỏt được thuộc biểu mụ đơn, cỏc tế bào đa diện khỏ đều đặn xếp sỏt nhau, ranh giới rừ (Hỡnh 3.2).
1
36
Hỡnh 3.2: Bề mặt màng ối người (giemsa, x 1000):
1. Nhân TBBM màng ối; 2. Ranh giới TBBM màng ối.
Trờn lỏt cắt đứng dọc, biểu mụ màng ối thuộc loại biểu mụ vuụng đơn
đứng trờn một màng đỏy mỏng. Bờn dưới màng đỏy là lớp đặc vụ mạch và thuần nhất (Hỡnh 3.3).
Hỡnh 3.3: Màng ối cắt đứng dọc (HE x 800):
1. TBBM màng ối; 2. Màng đáy; 3. Lớp đặc; 4. Màng đệm.
Sau khi xử lý bằng ammnium 10% và nạo bỏ biểu mụ, màng đỏy của màng ối mỏng, bề mặt nhẵn, độđàn hồi tốt. 1 2 2 1 3 4
37
Vựng này được chọn làm nền nuụi cấy tấm BMGM. 3.1.1.3. Màng ối lấy ở vựng 15 cm tớnh từ rỡa bỏnh rau:
Màng ối rất mỏng, biểu mụ là biểu mụ vuụng đơn thấp, màng đỏy mỏng và dễ rỏch khi xử lý bằng ammonium 10%
3.1.2. Lựa chọn phương phỏp xử lý màng ối:
3.1.2.1. Cấu trỳc vi thể của tấm màng ối khụng nạo biểu mụ: Trờn lỏt cắt đứng dọc, màng ối gồm 3 lớp rừ: trờn cựng là biểu mụ vuụng đơn, dưới biểu mụ là màng đỏy mỏng, dưới màng đỏy là một lớp trung mụ vụ mạch và thuần nhất (Hỡnh3.4).
3.1.2.2. Cấu trỳc vi thể của tấm màng ối nạo biểu mụ bằng cơ học: Trờn lỏt cắt đứng dọc: màng ối gồm 3 lớp: lớp biểu mụ khụng rừ, thỉnh thoảng cũn sút một vài tế bào biểu mụ, màng đỏy và lớp trung mụ cú cấu trỳc rừ (Hỡnh 3.5). 3.1.2.3. Cấu trỳc vi thể của tấm màng ối nạo biểu mụ bằng dung dịch Ammonium 10%: Màng ối rất mỏng, lớp biểu mụ và lớp trung mụ đó bị nạo bỏ toàn bộ, phần cũn lại chỉ là lớp màng đỏy hoặc cũn dớnh một số lỏ sợi collage nhỏ (Hỡnh 3.6) Hỡnh 3.4. Màng ối khụng nạo biểu mụ(H.E x 250) Hỡnh 3.5. Màng ối nạo biểu mụ bằng cơ học(H.E x 250) Hỡnh 3.6. Màng ối nạo biểu mụ bằng Ammonium(H.E x 250)
38 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nuụi cấy tế bào gốc vựng rỡa giỏc mạc trờn tấm màng ối khụng nạo biểu mụ và nạo biểu mụ bằng cơ học: hầu hết cỏc mẫu nuụi cấy khụng mọc. Một vài mẫu mọc nhưng rất chậm. Sau 2-3 tuần, tấm biểu mụ chưa cú cấu trỳc điển hỡnh của biểu mụ giỏc mạc, chỉ gồm 2-3 hàng tế bào dẹt. Sự phỏt triển của cỏc tế bào biểu mụ khụng liờn tục, tấm biểu mụ cú những chỗ trống (Hỡnh 3.7, 3.8). Hỡnh 3.7. Tấm biểu mụ nuụi trờn màng ối cũn biểu mụ (Giemsa x200) Hỡnh 3.8. Tấm biểu mụ nuụi trờn màng ối nạo biểu mụ bằng cơ học (Giemsa x200) Hỡnh 3.9. Tấm biểu mụ nuụi trờn màng ối nạo biểu mụ bằng Ammonium (Giemsa x200)
Nuụi cấy tế bào gốc vựng rỡa giỏc mạc trờn tấm màng ối nạo biểu mụ bằng Ammonium 10%: Khi nuụi tế bào gốc vựng rỡa giỏc mạc trờn màng ối tươi và màng ối ró đụng, cỏc tế bào gốc vựng rỡa giỏc mạc phỏt triển nhanh.
Đến ngày thứ 10 cỏc tế bào đó lan kớn đỏy của lồng nuụi cấy. Sau 2- 3 tuần, từ một mảnh mụ cú kớch thước 1mm x 1mm, cỏc tế bào gốc vựng rỡa đó tạo thành một tấm biểu mụ cú diện tớch 4cm2. Tấm biểu mụ là một biểu mụ lỏt tầng khụng sừng hoỏ gồm 4-5 hàng tế bào (Hỡnh 3.9). Những tấm biểu mụ này đó được ghộp cho thỏ và người bị bỏng. Kết quả ghộp rất khả quan.
Kết luận: Chọn phương phỏp xử lý màng ối bằng ammonium 10% và nạo biểu mụ nhẹ nhàng bằng cỏi nạo biểu mụ, qui trỡnh gồm cỏc bước sau:
1. Cỏc tấm màng ối kớch thước 3 x 3 cm được rửa trong DMSO với cỏc nồng độ khỏc nhau.
39
2. Rửa bằng PBS.
3. Ngõm trong Ammonium 10%. 4. Nạo bỏ lớp biểu mụ và trung mụ. 5. Rửa lại bằng PBS.
6. Bảo quản màng ối đó xử lý trong dung dịch DMSO 15% ở nhiệt độ -800 C (sử dụng trong 6 thỏng).
7. Khi sử dụng, ró đụng ở nhiệt độ phũng, rửa lại bằng PBS. 8. Căng màng ối lờn phiến hoặc lồng nuụi cấy.
3.2. Lựa chọn phương phỏp xử lý mảnh vựng rỡa để nuụi cấy
3.2.1. Mẫu mụ vựng rỡa giỏc mạc thỏ được chuẩn bị cho nuụi cấy
- Mẫu mụ vựng rỡa khụng xử lý enzym: Biểu mụ thuộc loại lỏt tầng khụng sừng húa gồm 10 -12 hàng tế bào; đứng trờn một màng đỏy khụng phẳng. Mụ nền lớp nụng cú một số mao mạch. Cỏc sợi collagen khụng đều, xếp đa hướng (Hỡnh 3.10).
- Mẫu mụ vựng rỡa được xử lý bằng dispase và trypsin cú hỡnh thỏi gần giống nhau: Biểu mụ mỏng, gồm khoảng 6 hàng tế bào; cỏc sợi collagen trong mụ nền cú xu hướng tỏch lớp (Hỡnh 3.11). Hỡnh 3.10: Mẫu mụ vựng rỡa khụng xử lý enzym (HE x250): 1. Biểu mô; 2. Lớp đệm. Hỡnh 3.11: Mẫu mụ vựng rỡa được xử lớ bằng dispase (HEx 250): 1.Biểu mô; 2. Lớp đệm. Tại vị trớ trớch thủ mảnh vựng rỡa, chỉ sau 1 tuần biểu mụ đó phủ kớn (Hỡnh 3.12) 1 2 1 2
40
Hỡnh 3.12:Biểu mụ vựng rỡa tỏi tạo sau 7 ngày trớch thủ (HE x 250) 1.Biểu mụ 2. Chõn bỡ giỏc mạc
3.2.2. Diện tớch phỏt triển của tấm BMVRGM nuụi cấy trờn nền màng ối màng ối
Cỏc mẫu nuụi cấy mọc rừ từ ngày thứ 4. Hầu như ở mọi thời điểm, diện tớch phỏt triển của tấm biểu mụ nuụi cấy của nhúm xử lý bằng trypsin (nhúm C) luụn nhỏ hơn so với diện tớch phỏt triển tấm biểu mụ của nhúm khụng xử lý (nhúm A) và nhúm xử lý bằng dispase (nhúm B). Sau 2 tuần nuụi cấy, nhúm khụng xử lý và nhúm xử lý bằng dispase cú diện tớch tương
đương nhau, đều lớn hơn nhúm xử lý bằng trypsin và gấp khoảng trờn 30 lần mẫu mụ vựng rỡa ban đầu (Bảng 3.1). Tuy nhiờn, diện tớch phỏt triển của tấm biểu mụ ở nhúm A khụng đều ở cỏc mẫu nghiờn cứu (SD rất lớn).
1
41
Bảng 3.1. Diện tớch của tấm BMVRGM nuụi cấy theo thời gian (đơn vị
103 pixel2)(*)
Ngày
Nhúm Ngày 4 Ngày 6 Ngày8 Ngày 10 Ngày 12 Ngày 14
Nhúm A 175 ± 146 267 ± 125 300 ± 181 424 ± 191 518 ± 150 580 ± 139 Nhúm B 49 ± 41 198 ± 87 315 ± 135 426 ± 47 509 ± 105 579 ± 53 Nhúm C 47 ± 34 85 ± 51 215 ± 103 354 ± 144 425 ± 94 458 ± 100 A-B <0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 B-C >0,05 <0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 P A-C <0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
* Đó trừ diện tớch mẫu mụ VR trước nuụi cấy là 18,83 ± 3.87 x 103pixel2.
3.2.3. Sự phỏt triển và lan rộng của tấm BMVRGM trong quỏ trỡnh nuụi cấy.
Sự phỏt triển và lan rộng của tấm BMVRGM được tớnh bằng khoảng cỏch xa nhất từ bờ của mẫu mụ vựng rỡa ban đầu đến bờ tấm biểu mụ (Hỡnh 3.13).
Hỡnh 3.13: Sự phỏt triển và lan rộng của tấm BMGM nuụi cấy (đơn vị pixel) của 3 nhúm thớ nghiệm (A, B và C) (pixel) 0 100 200 300 400 500 600 700 Khoảng cách (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8 Ngày
10 Ngày 12 Ngày 14 Thời gian Nhóm A Nhóm B Nhóm C
42
Biểu đồ trờn cho thấy : Tại mọi thời điểm, sự phỏt triển và lan rộng của tấm BMGM nuụi cấy ở nhúm C luụn nhỏ nhất. Ở nhúm A, tấm BMGM phỏt triển và lan rộng sớm; từ ngày thứ 10, tấm BMGM hầu như khụng phỏt triển nữa. Ở nhúm B, tấm BMGM phỏt triển và lan rộng liờn tục kiểu tuyến tớnh. Sự phỏt triển và lan rộng của tấm BMGM ở nhúm B đạt giỏ trị cao nhất vào ngày thứ 14, lớn hơn giỏ trị của nhúm A và C.
3.2.4. Hỡnh thỏi của tấm BMGM sau nuụi cấy
* 4 ngày sau khi cõy mảnh vựng rỡa trờn nền màng ối, quan sỏt bằng kớnh hiển vi soi nổi bắt đầu thấy cỏc tế bào biểu mụ tăng sinh bũ ra xung quanh (Hỡnh 3.14)
Hỡnh 3.14: Tấm biểu mụ nuụi cấy ngày thứ 4. (KHV soi nổi x 25): 1. Mẫu mụ vựng rỡa; 2. Bờ của tấm biểu mụ nuụi cấy;
3. Nền màng ối
*10 -14 ngày sau khi nuụi cấy, cỏc tế bào biểu mụ tăng sinh phủ kớn
đỏy lồng nuụi cấy. Trờn phiến đồ nhuộm giemsa bề mặt, cỏc tế bào biểu mụ cú hỡnh đa diện, nhõn trũn, lớn, trong nhõn nhiều chất nhiễm sắc (Hỡnh 3.15). Trờn cỏc lỏt cắt dọc được nhuộm màu H.E, tấm biểu
1
2
43
mụ cú 1 hàng tế bào, cỏc tế bào đứng sỏt nhau và bỏm chặt vào màng
ối. Gặp nhiều hỡnh ảnh tế bào đang phõn chia (Hỡnh3.16).
Hỡnh 3.15: Bề mặt tấm biểu mụ nuụi cấy 10 ngày (Giemsa x 200)
Hỡnh 3.16: Tấm biểu mụ nuụi cấy 10 ngày (H.E x 250); 1. Tế bào phõn chia 2. màng ối
Cỏc tế bào biểu mụ tăng sinh chen vào giữa màng ối và mặt dưới mảnh mụ vựng rỡa. Mảnh mụ vựng rỡa được lấy bỏ đi một cỏch dễ dàng (Hỡnh 3.17) .
Hỡnh 3.17. Tấm biểu mụ nuụi cấy 12 ngày, vựng đặt mảnh VRGM(H.E x 250) 1.Mảnh mụ vựng rỡa 2. Tấm biểu mụ
1
2
1
44
*14-18 ngày sau khi nuụi cấy, sau khi tiến hành kỹ thuật tạo tầng, tấm biểu mụ cú từ 3-5 hàng tế bào, hàng tế bào trờn cựng dẹt, cỏc tế bào
đứng rất sỏt nhau và bỏm chặt vào màng ối (Hỡnh 3.18, 3.19).
Hỡnh 3.18: Bề mặt tấm biểu mụ nuụi cấy 16 ngày (Giemsa x 200)
Hỡnh 3.19: Tấm biểu mụ nuụi cấy 14 ngày (Nhuộm huỳnh quang x 250)
Kết luận: Chọn phương phỏp xử lý mẫu mụ vung rỡa giỏc mạc để nuụi cấy bằng dispase II 2,4 UI/ml và EDTA 0,02%
3.3. Lựa chọn mụi trường nuụi cấy:
Nuụi cấy những mảnh VRGM khụng xử lý enzym trong mụi trường DMEM do Polivac cung cấp cú bổ xung FBS (A) hoặc BS (B), khỏng sinh, khỏng nấm và mụi trường SHEM của hóng Gibo cú bổ xung EGF, FBS, insulin, khỏng sinh, khỏng nấm (C), kết quả như sau (Bảng 3.2): (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.2 : Lựa chọn mụi trường nuụi cấy
A B C Đợt MT Số mẫu nuụi Số mẫu mọc Số mẫu nuụi Số mẫu mọc Số mẫu nuụi Số mẫu mọc 1 6 0 6 0 6 2 2 6 2 6 1 6 3
45
Cỏc mẫu nuụi bằng DMEM do Polivac cung cấp cú bổ xung FBS (A) hoặc BS (B), khỏng sinh, khỏng nấm mọc chậm. Tấm biểu mụ mỏng chỉ gồm 1-2 hàng tế bào.
Sau khi lựa chọn được phương phỏp xử lý mảnh vựng rỡa, lựa chọn
được phương phỏp nuụi cấy, thay đổi cỏch pha mụi trường, chỳng tụi đó tiến hành nuụi 81 mẫu VRGM thỏ và 20 mẫu VRGM người: Tỉ lệ mọc là 100%. Những mẫu này dựng ghộp lại cho thỏ hoặc bệnh nhõn và để nghiờn cứu.
Kết luận: Chọn mụi trường SHEM cú bổ xung PBS, EGF, insulin, penicilin, streptomycin, amphotericin B.
3.4. Lựa chọn phương phỏp nuụi cấy.
3.4.1. Tỷ lệ nuụi tạo thành cụng tấm biểu mụ giỏc mạc (Bảng 3.3)
Bảng 3.3: Tỉ lệ nuụi cấy thành cụng tấm biểu mụ giỏc mạc
Nuụi bằng mảnh mụ Nuụi bằng dịch treo
Đợt Số mẫu nuụi Số mẫu mọc Tỷ lệ mọc (%) Số mẫu nuụi Số mẫu mọc Tỷ lệ mọc (%) 1 6 3 50 6 0 0 2 3 2 66 2 0 0 3 6 6 100 6 6 100 Tổng 15 12 80 14 6 42,8
Nhận xột: qua 3 đợt nuụi cấy đầu tiờn, chỳng tụi thấy : tỷ lệ mọc của phương phỏp nuụi bằng mảnh mụ cao hơn nuụi bằng dịch treo. Ngay lần nuụi đầu tiờn bằng mảnh mụ đó cú 50% số mẫu mọc, cỏc lần tiếp theo tỷ lệ mọc ngày càng cao. Lần nuụi thứ ba, 100% số mẫu đều mọc. Chỳng tụi đó tiến hành nuụi nhiều đợt tiếp, tổng số 81 mẫu mụ vựng rỡa, tỷ lệ mọc là 100%
3.4.2. Chất lượng của tấm biểu mụ
46
- 4 ngày sau nuụi cấy: rải rỏc cú một số tế bào bỏm vào nền màng ối (Hỡnh 3.20)
Hỡnh 3.20. Nuụi cấy bằng dịch treo 4 ngày( Giemsa x 400)
- 12-14 ngày sau nuụi cấy: cỏc tế bào biểu mụ mọc kớn đỏy của lồng nuụi cấy
- 16-18 ngày sau nuụi cấy: tấm biểu mụ đó tạo tầng, bề mặt của tấm biểu mụ khụng phẳng, độ dày của biểu mụ khụng đều, nơi cú 2-3 hàng tế bào, nơi cú 5-6 hàng tế bào. Cỏc tế bào biểu mụ lớp trờn cựng dẹt. Cỏc tế bào lớp đỏy dỏn sỏt vào màng ối (Hỡnh 3.21).
Nuụi cấy bằng mảnh mụ
- 4 ngày sau nuụi cấy: quan sỏt thấy cỏc tế bào biểu mụ đó phỏt triển lan ra xung quanh mảnh mụ. (Hỡnh 3.22) Hỡnh 3.22: Tấm biểu mụ nuụi cấy ngày thứ 3 (Kớnh hiển vi soi nổi x 30) 1. Mảnh mụ vựng rỡa; 2. Bờ của tấm biểu mụ; 3. Nền màng ối 2 3 1
47
- 10-12 ngày sau nuụi cấy: cỏc tế bào biểu mụ đó phủ kớn đỏy của lồng nuụi cấy.
- 14-16 ngày sau nuụi cấy: bề mặt tấm biểu mụ phẳng, cỏc tế bào cú hỡnh đa diện, ranh giới rừ. Biểu mụ cú độ dày đều đặn và gồm 4-5 hàng tế bào. Cỏc tế
bào lớp trờn cựng dẹt, cũn nhõn. Lớp đỏy của biểu mụ gắn chặt vào màng ối. (Hỡnh 3.23)
Hỡnh 3.21. Tấm biểu mụ nuụi cấy bằng dịch treo 18 ngày (H.E x500) 1.Màng ối 2.Tế bào biểu mụ.
Hỡnh 3.23. Tấm biểu mụ nuụi cấy bằng mảnh mụ vựng rỡa 16 ngày (H.E x500)
1.Màng ối 2.Tế bào biểu mụ.
Kết luận: Nuụi cấy bằng mảnh mụ VRGM đơn giản và tạo đựơc tấm biểu mụ giỏc mạc cú chất lượng tốt
3.5. Xõy dựng qui trỡnh định danh, xỏc định điều kiện nuụi cấy tế bào gốc BMVR và tạo tấm biểu mụ giỏc mạc nuụi cấy. Đỏnh giỏ chất lượng gốc BMVR và tạo tấm biểu mụ giỏc mạc nuụi cấy. Đỏnh giỏ chất lượng tế bào của tấm BMVR nuụi cấy. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi nuụi cấy được tấm biểu mụ kớch thước 4 cm2, tiến hành định danh tế bào của tấm biểu mụ nuụi cấy bằng:
- Cỏc kỹ thuật hiển vi quang học: nhuộm giemsa (180 mẫu), H.E (120 mẫu).
2
1
2
48
- Hiển vi điện tử quột (4 mẫu) và xuyờn (4 mẫu). - Hoỏ mụ, hoỏ mụ miễn dịch (4 mẫu).
Ngày thứ 4 sau nuụi cấy, bắt đầu quan sỏt thấy cỏc tế bào biểu mụ từ mảnh mụ vựng rỡa phỏt triển lan ra xung quanh mảnh mụ. Sau 10-14 ngày cỏc tế bào
đó phủ kớn đỏy của giếng nuụi cấy. Tiếp tục tạo tầng cho tấm biểu mụ trong 4-5 ngày sẽ thu được một tấm biểu mụ giỏc mạc dựng để ghộp.
3.5.1. Cấu trỳc vi thể của tấm biểu mụ nuụi cấy
Trờn cỏc tiờu bản nhuộm giemsa, cỏc tế bào bề mặt của tấm biểu mụ hỡnh đa diện, cú một nhõn trũn nằm giữa tế bào và hơi lồi lờn. Cỏc tế bào nằm rất sỏt nhau. (Hỡnh 3.24)
Hỡnh 3.24 : Bề mặt tấm biểu mụ nuụi cấy 18 ngày (giemsa x250)
Trờn cỏc lỏt cắt dọc tấm biểu mụ được nhuộm H.E thấy: màng ối rất mỏng trụng giống màng Bowman của giỏc mạc. Biểu mụ đứng trờn màng ối gồm 4-5