bằng ghộp tấm biểu mụ giỏc mạc nuụi cấy
Lần đầu tiờn phương phỏp này được Pellegrini mụ tả vào năm 1997. Tế bào biểu mụ vựng rỡa được lấy từ mắt bờn lành nếu một mắt bị tổn thương, hoặc lấy ở vựng rỡa cũn bỡnh thường trờn mắt bị tổn thương tế bào gốc một phần hoặc từ người thõn hoặc từ vựng rỡa của người mới tử vong nếu bệnh nhõn bị tổn thương 2 mắt. Mảnh vựng rỡa mang tế bào gốc của biểu mụ được nuụi cấy, nhõn lờn và tạo nờn tấm tế bào biểu mụ giỏc mạc. Sau khi
21
phẫu tớch hết tổ chức xơ mạch khụng bỡnh thường trờn bề mặt giỏc mạc và vựng rỡa, tấm tế bào biểu mụ được cố định trờn bề mặt giỏc mạc [6, 12, 18, 19]. Về mặt lý thuyết, kỹ thuật này cú một vài ưu điểm vượt trội hơn cỏc phương phỏp khỏc đó được ỏp dụng từ trước. Mảnh vựng rỡa cần cho quỏ trỡnh nuụi cấy nhỏ hơn gấp nhiều lần so với mảnh vựng rỡa sử dụng trong phẫu thuật ghộp biểu mụ vựng rỡa khỏc. Quỏ trỡnh nuụi cấy đó giảm thiểu số
lượng tế bào khụng cú chức năng bỡnh thường nằm trong mụ của người cho. Việc sinh thiết cỏc tế bào gốc ở vựng rỡa cú thể nhắc lại nếu cần thiết. Một ưu
điểm vượt trội khỏc của kỹ thuật này so với kỹ thuật ghộp rỡa kinh điển đú là giảm nguy cơ thải loại mảnh ghộp vỡ khụng cú mặt của cỏc tế bào Langerhan
đúng vai trũ trỡnh diện khỏng nguyờn [22, 24]. Cho tới nay, đó cú nhiều bỏo cỏo cụng bố kết quả của phẫu thuật điều trị di chứng bỏng do húa chất hoặc nhiệt, hội chứng Stevens-Johnson, viờm BMNC món tớnh ( viờm kết mạc mựa xuõn, bệnh trứng cỏ đỏ, viờm giỏc mạc do nguyờn nhõn thần kinh…)đều cho những kết quả và tỷ lệ thành cụng tương tự nhau. Tsai R. J. F. và cộng sự
(2000) đó nuụi cấy tự thõn tế bào BMVR của người trờn màng ối để ghộp cho những bệnh nhõn suy giảm tế bào gốc VRGM một bờn. Nhúm nghiờn cứu tiến hành lấy mẫu VRGM từ những mắt khoẻ mạnh cũn lại của 6 bệnh nhõn để nuụi cấy trờn màng ối. Sau 2- 3 tuần nuụi cấy, TBBM đó phỏt triển thành tấm hỡnh trũn đường kớnh khoảng 2-3 cm và được ghộp cho mắt tổn thương. Kết quả cho thấy: ghộp tế bào BMVR tự thõn nuụi cấy trờn màng ối là một phương phỏp đơn giản và cú hiệu quả trong việc tỏi tạo lại bề mặt giỏc mạc và phục hồi thị lực cho những bệnh nhõn suy giảm tế bào gốc BMVR một bờn [45]. Năm 2002, Shimazaki J. và cộng sự nuụi cấy tế bào BMVR trờn màng ối để ghộp cho những bệnh nhõn tổn thương nặng bề mặt nhón cầu, kết quả cũng cho thấy: khụng những bề mặt nhón cầu được cải thiện tốt mà thị lực cũng tăng [49].
22
Túm lại, nuụi tạo tấm biểu mụ giỏc mạc từ tế bào gốc vựng rỡa giỏc mạc để ghộp điều trị cho cỏc bệnh nhõn bị hội chứng suy giảm vựng rỡa do cỏc nguyờn nhõn khỏc nhau là một phương phỏp hiện đại và hiệu quả. Tuy nhiờn, xung quanh phương phỏp này cũn nhiều vấn đề cần nghiờn cứu.
23
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. Đối tượng nghiờn cứu
* Màng ối người
* Đối tượng nghiờn cứu thực nghiệm: Thỏ chủng Orytolagus Cuniculus
cả 2 giống, khỏe mạnh, trọng lượng 2 kg ± 0,2 kg do trung tõm nghiờn cứu dờ và thỏ Sơn tõy cung cấp.Thỏ được nuụi trong cựng điều kiện phũng thớ nghiệm từ 5 ngày trước khi làm thực nghiệm và trong suốt thời gian thực nghiệm.
* Mảnh mụ vựng rỡa giỏc mạc lấy từ mắt lành, từ vựng rỡa cũn bỡnh thường của mắt bệnh hoặc từ vựng rỡa giỏc mạc hiến.
2.2 Mụ hỡnh nghiờn cứu
Mễ HèNH NGHIấN CỨU
Nghiờn cứu qui trỡng tạo tấm
màngối làm nền nuụi cấy Nghiờn cvà xứu qui trỡnh trớch thửlý vựng rỡa ủ
Nuụi cấy
Nghiờn cứu mụi trường phự hợp
Ghộp thực nghiệm cho thỏ Ghộp cho BN bỏng giỏc mạc Gõy bỏng cho thỏ
Định danh tếbào của tấm BM nuụi cấy
24
2.3. Phương phỏp nghiờn cứu
2.3.1. Xõy dựng qui trỡnh thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm nền nuụi cấy. người làm nền nuụi cấy.
- Bỏnh rau và màng bọc thai của cỏc sản phụ mổđẻ tại bệnh viện Phụ - Sản Hà nội. Cỏc sản phụ khoẻ mạnh và đó được sàng lọc cỏc bệnh lõy truyền: (HIV, HbsAg, giang mai), khụng cú nhiễm trựng toàn thõn, chưa vỡ ối hoặc vỡ ối trước 6 giờ.
- Tỏch màng ối rời khỏi màng bọc thai
- Định khu màng ối sẽ lấy để làm nền nuụi cấy bằng cỏch: Lấy màng
ối ở 3 vị trớ khỏc nhau: trờn bề mặt bỏnh rau (1), vựng 10 cm kể từ rỡa bỏnh rau (2), vựng ngoài 10cm kể từ rỡa bỏnh rau (3) (Hỡnh 2.2), làm tiờu bản vi thể, đỏnh giỏ cấu trỳc hỡnh thỏi 3 vựng của màng ối và quyết định vựng sẽ lấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
để làm nền nuụi cấy. Cắt màng ối ở vựng đạt tiờu chuẩn thành cỏc mảnh cú diện tớch 3x3 cm. Hỡnh 2.2: Bỏnh rau và màng rau - Xử lý cỏc mảnh màng ối theo 3 cỏch: + Để nguyờn lớp biểu mụ của màng ối + Nạo vỏ lớp biểu mụ bằng cơ học: Dựng nạo biểu mụ nạo nhẹ nhàng nhiều lần mặt biểu mụ của tấm màng ối, rửa lại bằng PBS cú bổ
xung penicilin, streptomycin và amphotericin B.
Dây rốn Bánh rau Màng rau Vùng lấy 1 2 3
25
+ Nạo bỏ lớp biểu mụ bằng ammonium 10% và cơ học:
• Cỏc tấm màng ối rửa trong DMSO với cỏc nồng độ khỏc nhau
• Rửa bằng PBS
• Ngõm trong Ammonium 10%
• Nạo bỏ lớp biểu mụ và trung mụ
• Rửa lại bằng PBS.
- Bảo quản màng ối đó xử lý trong dung dịch DMSO 15% ở nhiệt độ -800C (sử dụng trong 6 thỏng).
- Khi sử dụng, ró đụng ở nhiệt độ phũng, rửa lại bằng PBS. - Căng màng ối lờn phiến hoặc lồng nuụi cấy.
- Làm tiờu bản vi thể 3 loại màng ối đó xử lý
- Nuụi cấy tế bào gốc vựng rỡa giỏc mạc: Chỉ tiờu nghiờn cứu:
+ Đỏnh giỏ sự phỏt triển của tế bào gốc VRGM trờn cỏc loại màng ối.
+ Đỏnh giỏ chất lượng của tấm biểu mụ giỏc mạc nuụi cấy trờn màng ối xử lý theo phương phỏp khỏc nhau.
2.3.2.Xõy dựng qui trỡnh trớch thủ và xử lý mẫu vựng rỡa giỏc mạc.
2..3.2.1. Thực nghiệm trờn thỏ: *Nuụi cấy bằng mảnh mụ:
- Giết thỏ hoặc gõy mờ thỏ
- Trớch thủ vựng rỡa giỏc mạc: + Vị trớ: 11h – 1h
+ Kớch thước: rộng 0,5-1mm, dài 2-3 mm, sõu 0,2mm + Kiểm tra cấu trỳc vi thể của mảnh VRGM
+ Mảnh vựng rỡa giỏc mạc được rửa bằng PBS cú bổ sung khỏng sinh, khỏng nấm.
+ Cắt nhỏ thành cỏc mảnh 1x1mm
26
+Khụng xử lý enzym
+Ủ trong dung dịch trypsin 0,1% + EDTA 0,1% trong tủấm 370, thời gian: 7 phỳt
+Ủ trong dung dịch dispase II 2,4 UI/ml trong tủấm 370. Dừng tỏc
động của dispase bằng EDTA 0,02% ở nhiệt độ phũng, thời gian 2- 3 phỳt.
- Nuụi cấy cỏc mảnh mụ đó được xử lý trờn nền màng ối. Đỏnh giỏ sự
phỏt triển của tế bào gốc VRGM và chất lượng của tấm BMGM nuụi cấy. - Theo dừi quỏ trỡnh hồi phục của vựng rỡa bị trớch thủ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
*Nuụi cấy bằng dịch treo:
- Giết thỏ, lấy toàn bộ giỏc mạc và VRGM - Rửa sạch giỏc mạc bằng PBS.
- Ủ giỏc mạc trong dispase II 2,4 UI/ml trong tủ 370C, 5% CO2, thời gian 1 giờ
- Dừng tỏc động của dispase bằng EDTA 0,02%, thời gian 2 phỳt. - Rửa bằng PBS
- Nạo lấy lớp biểu mụ
- Ly tõm lấy cỏc tế bào biểu mụ
- Tạo dịch treo cú mật độ tế bào 1x105 tế bào/ml. -Nuụi cấy trong lồng nuụi cấy.
2.3.2.2. Thử nghiệm trờn bệnh nhõn tự nguyện. Tiến hành sau khi cú kết quảđịnh hướng của thực nghiệm trờn thỏ.
- Gõy tờ gúc mắt cho bệnh nhõn
- Trớch thủ mảnh vựng rỡa trờn mắt lành nếu bệnh nhõn bị tổn thương 1 bờn hoặc phần vựng rỡa bỡnh thường nếu bệnh nhõn bị tổn thương 2 mắt.
- Vị trớ: 11h – 1 h
- Kớch thước: rộng 1,5mm, dài 3mm, sõu 0,2mm. - Rửa bằng PBS cú pha khỏng sinh, khỏng nấm
27
- Cắt nhỏ thành cỏc mảnh 1x1mm - Nuụi cấy trong mụi trường nuụi cấy
*Mảnh vựng rỡa cũng cú thể lấy từ vựng rỡa của giỏc mạc hiến. 2.3.2.3. Chỉ tiờu nghiờn cứu:
- Tốc độ phỏt triển của cỏc tế bào biểu mụ - Chất lượng của tấm biểu mụ
2.3.3. Lựa chọn mụi trường nuụi cấy:
*Cỏc loại mụi trường
- Mụi trường DMEM (Dulbecco’s modified Eagles medium) do viện Vaccin Trung ương (Poliovac) cung cấp, bổ sung: SHB (Sodium Hydrogen Bicarbonate) và 10% huyết thanh bào thai bờ (Fetal Bovine Serum – FBS)
- Mụi trường DMEM do Poliovac cung cấp, bổ sung SHB và 10% huyết thanh bũ (Bovine Serum-BS).
- Mụi trường SHEM (Supplemental Hormonal Epithelial Medium) gồm: DMEM/F12 tỉ lệ 1:1 của Gibco, bổ xung: peniciline 100UI/ml. Streptomycin 100àg/ml, Amphotericin B 200 àg/ml, Insulin 5àg/ml, 5% FBS, EGF (Epithelial growth factor).
* Nuụi cấy mảnh mụ hoặc dịch treo của biểu mụ vựng rỡa giỏc mạc trong tủ 370C, 5% CO2. Thay mụi trường 2 ngày 1 lần. Theo dừi sự phỏt triển của cỏc tế bào biểu mụ giỏc mạc bằng kớnh hiển vi soi nổi. Khi cỏc tế bào
đó phủ kớn đỏy của lồng nuụi cấy, sử dụng kỹ thuật tạo tầng (air lifting) để
tăng số hàng cho tấm biểu mụ nuụi cấy trong thời gian 2-4 ngày.
* Lấy tấm biểu mụ nuụi cấy để định danh hoặc ghộp lại cho thỏ (trong thực nghiệm) hoặc cho bệnh nhõn (trờn thử nghiệm lõm sàng).
2.3.4. Ghộp thực nghiệm trờn thỏ
28
• Gõy mờ tĩnh mạch cho thỏ bằng thiopentan với liều 10mg/kg qua đường tĩnh mạch tai.
• Gõy bỏng bằng phương phỏp “in dấu” dung dịch NaOH 3% trong 7 giõy trờn giỏc mạc và vựng rỡa giỏc mạc.
• Rửa mắt bằng nước muối sinh lý sau gõy bỏng 1 phỳt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Giết thỏ lấy mắt làm tiờu bản vi thể để kiểm tra kỹ thuật gõy bỏng vào cỏc thời điểm: 1 tuần, 2 tuần, 1,5 thỏng sau khi gõy bỏng. 2.3.4.2. Ghộp thực nghiệm cho thỏ a) Mụ hỡnh nghiờn cứu thực nghiệm (Hỡnh 2.3) Hỡnh 2.3: Mụ hỡnh nghiờn cứu thực nghiệm Thỏ TN 30 ngày Gõy bỏng (MP) Lấy mảnh VR (MT) Ghộp tấm biểu mụ Nuụi cấy tạo tấm BM trờn màngối Lấy mắt làm t/bản mụ học Xử lý màng ối Màng ối bảo quản lạnh Đỏnh giỏ cỏc chỉ tiờu mụ học Nhận định kết quả Theo dừi dọc Theo dừi dọc
29
b) Phõn nhúm thực nghiệm và qui trỡnh nghiờn cứu thực nghiệm (Hỡnh 2.4) 0 7 ngày sau bỏng 15 ngày sau bỏng 45 ngày sau bỏng 7 ngày sau ghộp 15 ngày sau ghộp 1 thỏng sau ghộp 3 thàng sau ghộp Lụ 0 Lụ 1 Lụ 2 Lụ 3 Lụ 4 Lụ 5 Lễ THÍ NGHIỆM ( 3thỏ/lụ) Lụ 6 Hỡnh 2.4: Phõn nhúm thực nghiệm c) Cỏch thức tiến hành phẫu thuật thực nghiệm
- Gõy mờ thỏđường tĩnh mạch bằng thiopentan - Mở kết mạc rỡa 360°
- Phẫu tớch tổ chức màng xơ mạch trờn giỏc mạc và củng mạc
- Chuẩn bị diện ghộp, bao gồm bề mặt giỏc mạc, vựng rỡa và củng mạc quanh rỡa, cỏch rỡa giỏc- củng mạc khoảng 5-7 mm
- Trải tấm tế bào biểu mụ giỏc mạc vựng rỡa nuụi cấy trờn bề mặt nhón cầu
- Dựng chỉ 9-0 để khõu cố định tấm tế bào biểu mụ trờn bề mặt nhón cầu bằng mũi chỉ rời
d) Theo dừi đỏnh giỏ tổn thương trờn mắt thỏ
- Khỏm đỏnh giỏ tổn thương trờn lõm sàng hội chứng suy giảm tế bào gốc trước phẫu thuật và sau phẫu thuật.
- Tiến hành test nhuộm màu trờn BMNC bằng Fluorescein
- Tra nhỏ thuốc tại mắt phẫu thuật hàng ngày bằng dung dịch khỏng sinh ofloxacin 4 lần/ngày, polydexa 4 lần/ngày
30
e) Cỏc chỉ tiờu nghiờn cứu trờn thực nghiệm -Toàn trạng của thỏ thực nghiệm
- Tỡnh trạng mắt thỏ
- Cấu trỳc vi thể và siờu vi thể của giỏc mạc ghộp tấm biểu mụ nuụi cấy
2.3.5. Ghộp trờn bệnh nhõn tỡnh nguyện
2.3.5.1. Lựa chọn bệnh nhõn:
* Bỏng kiềm một mắt ở giai đoạn mạn tớnh * Cú hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM:
- Loột giỏc mạc khú hàn gắn
- Xơ mạch xõm lấn từ kết mạc qua rỡa lờn bề mặt giỏc mạc - Trúc biểu mụ tỏi phỏt
2.3..5.2. Qui trỡnh khỏm và phẫu thuật ghộp tấm biểu mụ. ` a) Đỏnh giỏ tỡnh trạng tổn thương BMNC trước phẫu thuật
- Đo thị lực của bệnh nhõn, nhón ỏp (nếu cú thểđược)
- Khỏm đỏnh giỏ tổn thương trờn lõm sàng hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM.
- Tiến hành cỏc test nhuộm màu trờn BMNC Fluorescein - Tiến hành cỏc test Schimer đỏnh giỏ màng phim nước mắt
- Tiến hành phương phỏp nhuộm tế bào trờn bề mặt giỏc mạc trước phẫu thuật.
b) Chuẩn bị bệnh nhõn
- Điều trị hiện tượng viờm của bề mặt nhón cầu: Tra mắt bằng Prednisolone acetate 1% từ 4 – 8 lần/ngày (tăng giảm liều và thời gian
điều trị tựy mức độ viờm), dung dịch khỏng sinh ofloxacine 0,5% 2 – 4 lần/ngày.
- Tăng cường dinh dưỡng bề mặt nhón cầu, củng cố chất lượng và số (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
31
lần/ngày, dinh dưỡng, tăng cường độ ẩm cho bề mặt nhón cầu dạng keo 3 lần/ngày.
- Điều trị viờm hoặc cỏc tổn thương khỏc của bờ mi:Tra mắt mỡ oflovid 1% 1 lần/ngày, chườm núng khụ và mat-xa da mi. Tạo hỡnh bờ mi mắt bằng phương phỏp ghộp niờm mạc mụi (phẫu thuật Sapejko).
c) Sinh thiết mảnh mụ vựng rỡa giỏc mạc bệnh nhõn d) Nuụi cấy tạo tấm biểu mụ giỏc mạc
e) Cỏch thức tiến hành phẫu thuật trờn bệnh nhõn
- Gõy mờ, theo dừi, hồi sức trong suốt quỏ trỡnh phẫu thuật. - Mở kết mạc rỡa 360°
- Phẫu tớch tổ chức xơ dưới kết mạc, giữ tối đa tổ chức kết mạc lành. - Phẫu tớch tổ chức màng xơ mạch trờn giỏc mạc và củng mạc.
- Chuẩn bị diện ghộp, bao gồm bề mặt giỏc mạc, vựng rỡa và củng mạc quanh rỡa, cỏch rỡa giỏc- củng mạc khoảng 5-7 mm.
- Trải tấm tế bào biểu mụ giỏc mạc vựng rỡa nuụi cấy trờn bề mặt nhón cầu - Dựng chỉ 9-0 để khõu cố định tấm tế bào biểu mụ trờn bề mặt nhón cầu bằng mũi chỉ liờn tục phối hợp với mũi rời - Đặt kớnh tiếp xỳc - Mảnh tổ chức màng xơ mạch phẫu tớch từ bề mặt giỏc mạc người gửi làm giải phẫu bệnh để nghiờn cứu cấu trỳc mụ học của màng xơ mạch trờn giỏc mạc.
f) Theo dừi bệnh nhõn sau phẫu thuật *Cỏc mốc thời gian theo dừi:
- Hàng ngày trong 2 tuần sau phẫu thuật - Sau phẫu thuật 3 tuần
- 2 tuần/lần trong 2 thỏng tiếp theo - 1 thỏng/lần trong thời gian tiếp theo *Đỏnh giỏ mắt sau phẫu thuật
32
- Đo thị lực, nhón ỏp trờn bệnh nhõn
- Test nhuộm màu Fluorescein đỏnh giỏ tỡnh trạng biểu mụ BMNC - Sử dụng cỏc test Schirmer đỏnh giỏ tỡnh trạng của phim nước mắt - Ghi nhận cỏc biểu hiện của thải loại mảnh ghộp, tăng sinh xơ mạch trờn bề mặt nhón cầu và/hoặc bề mặt giỏc mạc, cỏc biểu hiện khỏc như hiện tượng viờm, cương tụ mạch mỏu.
- Trờn bệnh nhõn, sau phẫu thuật 1 thỏng, 3 thỏng, 6 thỏng tiến hành phương phỏp nhuộm tế bào trờn bề mặt biểu mụ giỏc mạc
g) Chăm súc sau phẫu thuật
- Thay băng, rửa mắt hàng ngày
- Phỏc đồđiều trị nội khoa ỏp dụng cho mọi trường hợp:
o Tra khỏng sinh tại mắt: Ofloxacin 4 lần/ngày, khi BMNC đó biểu mụ húa thỡ giảm liều khỏng sinh 2 lần/ngày, hết nguy cơ nhiễm khuẩn