STT Chỉ tiêu Phương pháp phân tích
1 Tổng hàm lượng chất khơ hịa tan Dùng chiết quang kế Atago 0-32
2 Độ ẩm (%) AOAC 934.06
3 pH Xác định bằng máy đo pH
4 Hàm lượng đường tổng (%) TCVN 4594-88
5 Hàm lượng đường khử (mg/g) Theo phương pháp của Miller, 1959 6 Hàm lượng amylose Theo phương pháp của Juliano, 1971 7 Hàm lượng amylopectin Theo phương pháp của Juliano, 1971 8 Hàm lượng tinh bột (%) TCVN 4594-88
9 Hàm lượng ethanol TCVN 5562-2009
10 Số tế bào nấm men (cfu/mL) Đếm trên buồng đếm hồng cầu
11 Hàm lượng puerarin Phân tích HPLC (theo phương pháp của Zhang và cộng sự 2004)
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng qt
Phân tích thành phần hóa học của ngun liệu.
Nội dung 1: Tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của
enzyme β-amylase thông qua việc khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme β-amylase.
Nội dung 2: Tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác dụng
của enzyme BSMA thông qua việc khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA.
Nội dung 3: Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa-sắn dây thông qua việc khảo sát
ảnh hưởng của pH, Brix, tỷ lệ nấm men trong điều kiện lên men ở nhiệt độ thường. Đánh giá chất lượng sản phẩm nước uống lên men từ sắn dây và dứa. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát được trình bày trong Hình 3.1
thủy phân tinh bột dụng của enzyme β- ệt độ, thời gian và β-amylase. óa q trình tổng c chất puerarin- ới tác dụng của BSMA thông qua sát ảnh hưởng của độ, thời gian và zyme BSMA.
a quá trình lên men -sắn dây thông qua sát ảnh hưởng của ỷ lệ nấm men trong lên men ở nhiệt độ
chất lượng sản c uống lên men từ dứa.
m nước uống lên men
tích.
Thuyết minh quy trình
Sắn dây sau khi sấy khơ sẽ được đem đi nghiền mịn và xác định các chỉ tiêu phân Hồ hóa: nhằm phá vỡ màng tế bào của tinh bột sắn dây, giúp cho tinh bột hòa tan trong nước dễ dàng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân
Đường hóa: nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho q trình chuyển hóa tinh bột thành đường (maltose và các dextrin). Giai đoạn này được thực hiện dưới tác dụng của enzyme β- amylase.
Xử lý BSMA: dung dịch sắn dây trong giai đoạn đường hóa sẽ tạo ra đường maltose và các dextrin… Vì vậy, việc bổ sung enzyme BSMA trong giai đoạn này nhằm thủy phân các đường trên thành các đường glucose, maltose đồng thời gắn các gốc
Quá trình sắn dây dưới tác amylase, pH, nhi nồng độ enzyme Tối ưu h hợp phứ maltose dư enzyme việc khảo pH, nhiệt nồng độ en Tối ưu hó nước dứa việc khảo pH, Bx, t điều kiện thường. Đánh giá phẩm nướ sắn dây và Đánh giá chất lượng sản phẩ từ sắn dây và dứa.
đường này vào các đường maltose-oligosaccharide khác theo liên kết 1-6 glucoside giúp tạo thành đường IMO cũng như làm thay đổi cấu trúc puerarin từ dạng khơng tan thành dạng tan trong nước. Trong q trình xử lý BSMA bổ sung 10% maltodextrin và dung dịch đệm natri citrate để tăng hoạt tính của enzyme.
Sau mỗi q trình xử lý enzyme đều có cơng đoạn vơ hoạt enzyme để khơng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme sau đó.
Nấu: nhằm mục đích dừng các phản ứng thủy phân bởi các enzyme trên đồng thời tiêu diệt các vi sinh vật gây hại có thể ảnh hưởng đến q trình lên men.
Làm nguội: nấm men không thể chịu được nhiệt độ cao, do đó cần tiến hành làm nguội dịch lên men đến nhiệt độ tối thích cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men (thường ở 28 ‒ 30oC). Đồng thời làm nguội nhằm đảm bảo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men.
Phối chế: nhằm tạo môi trường thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men giúp quá trình lên men đạt hiệu quả cao. Ở giai đoạn này cần xác định các giá trị pH, Brix, nhiệt độ thích hợp cho q trình lên men.
Lên men chính: nhằm mục đích chính là chuyển đường thành rượu.
Lọc thô: nhằm loại bỏ phần xác, bã sắn dây và dứa nguyên liệu sau khi lên men chính, mang lại giá trị cảm quan cho sản phẩm.
Lên men phụ: nhằm ổn định chất lượng nước uống lên men, làm sáng trong và làm tăng hương cho sản phẩm.
Hình 3.2 trình bày quy trình nhân giống Saccharomyces oviformis ở quy mơ
phịng thí nghiệm.
Quy trình nhân giống nấm men
Lọc: dịch thủy phân tinh bột sắn dây và dứa sau khi phối trộn tiến hành lọc nhằm loại bỏ bã, tạp chất, cặn có trong dung dịch.
Cân bằng dinh dưỡng: nhằm tạo mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men.
Tiệt trùng: nhằm tiêu diệt các vi sinh vật có trong dịch sắn dây-dứa đồng thời đảm bảo môi trường vô trùng tuyệt đối giúp nấm men sinh trưởng và phát triển thuận lợi.
Nhân giống: giúp cung cấp đủ lượng giống cho quá trình lên men đồng thời để giữ giống.
3.3.2. Bố trí thí nghiệm
3.3.2.1. Phân tích thành phần hóa học của ngun liệu sắn dây a. Mục đích
Sắn dây là loại ngun liệu có thành phần dinh dưỡng phù hợp cho các sản phẩm lên men, tuy nhiên các thành phần này thường thay đổi theo điều kiện khí hậu, đất đai, vùng trồng. Vì vậy, việc phân tích các thành phần cơ bản của nguyên liệu trước khi tiến hành thí nghiệm là một điều rất cần thiết.
b. Các chỉ tiêu phân tích ‒ Độ ẩm ‒ Hàm lượng puerarin ‒ Hàm lượng đường tổng số ‒ Hàm lượng amylose ‒ Hàm lượng amylopectin ‒ Hàm lượng tinh bột
Nội dung 1: Tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase
3.3.2.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase
a. Mục đích
Xác định nồng độ cơ chất thích hợp cho q trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase để hàm lượng đường khử tạo thành là cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 1 nhân tố khảo sát, các nhân tố còn lại được cố định (Hình 3.3).
Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây
Nhân tố A: nồng độ cơ chất thay đổi ở 5 mức độ
A1: 8% A2: 10%
A3: 12% A4: 14%
A5: 16%
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 x 3 = 15
Tiến hành thí nghiệm:
Mẫu bột sắn dây tương ứng với các nồng độ khảo sát 8, 10, 12, 14 và 16%, pH 5,5 sẽ được đem đi hồ hóa với nước trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 90oC. Sau khi hồ hóa, dịch hồ tinh bột được hạ nhiệt độ xuống 60oC, thực hiện q trình đường hóa với việc bổ sung enzyme β-amylase ở nồng độ 20 U/g tinh bột, tiến hành đường hóa trong thời gian 2 giờ. Dịch thủy phân sau đường hóa sẽ được vơ hoạt enzyme ở nhiệt độ 90oC, 15 phút, sau đó lọc và xác định hàm lượng đường khử sinh ra.
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng đường khử.
3.3.2.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase
a. Mục đích
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 1 nhân tố khảo sát, các nhân tố cịn lại được cố định (Hình 3.4).
Nhân tố B: giá trị pH, thay đổi ở 5 mức độ:
B1 : 5 B2: 5,5
B3: 6 B4: 6,5
B5: 7
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 x 3 = 15
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của pH đến q trình thủy phân tinh bột sắn dây
Tiến hành thí nghiệm:
Mẫu 5 g bột sắn dây ứng với nồng độ cơ chất tìm được từ thí nghiệm 1 sẽ đem đi hồ hóa ở 90oC trong 30 phút. Thí nghiệm được tiến hành tương tự thí nghiệm 1 nhưng giá trị pH được thay đổi ở 5 mức độ 5 đến 7 (sử dụng dung dịch đệm để điều chỉnh pH dung dịch).
Dịch thủy phân sau đường hóa sẽ được vơ hoạt enzyme ở nhiệt độ 90oC, 15 phút, sau đó lọc và xác định hàm lượng đường khử sinh ra.
3.3.2.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme β-amylase đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây
a. Mục đích
Xác định được giá trị nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme tối ưu để thu được hàm lượng đường khử cao nhất và đồng thời là cơ sở giúp các quá trình chế biến tiếp theo đạt hiệu suất cao.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 nhân tố khảo sát, các nhân tố còn lại được cố định. Phương pháp bề mặt đáp ứng theo mơ hình Box-Behnken được sử dụng để xác định các thông số tối ưu của 3 nhân tố khảo sát (nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme). Mức độ của các nhân tố được thể hiện ở Bảng 3.3, sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.4.
Bảng 3.3: Các nhân tố và mức độ khảo sát trong quá trình thủy phân tinh bột sắn dây
Ký hiệu Nhân tố Đơn vị Mức độ
C Nhiệt độ °C Giờ U/g tinh bột 45 55 65 D Thời gian 2 4 6 E Nồng độ 20 40 60
Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken
Số TT Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) (U/g tinh bột)Nồng độ
1 45 2 40 2 45 6 40 3 45 4 20 4 45 4 60 5 65 2 40 6 65 6 40 7 65 4 20 8 65 4 60 9 55 2 20 10 55 2 60 11 55 6 20 12 55 6 60 13 55 4 40 14 55 4 40 15 55 4 40
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ β-amylase đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây
Tiến hành thí nghiệm:
Mẫu 5 g bột sắn dây sau khi tìm được các giá trị thích hợp ở thí nghiệm 1 và 2 sẽ tiếp tục được khảo sát ảnh hưởng của các nhân tố nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme β- amylase tối ưu để hàm lượng đường khử sinh ra là cao nhất.
Thí nghiệm được tiến hành tương tự thí nghiệm 1 với 45 đơn vị thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken.
Dịch thủy phân sau đường hóa sẽ được vơ hoạt enzyme ở nhiệt độ 90oC, 15 phút, sau đó lọc và xác định hàm lượng đường khử sinh ra.
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng đường khử.
Nội dung 2: Tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose từ sắn dây và maltodextrin bằng enzyme maltogenic amylase
3.3.2.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác dụng của enzyme BSMA
a. Mục đích
Xác định được giá trị pH thích hợp để enzyme BSMA thể hiện hoạt tính tốt nhất sao cho hàm lượng phức puerarin-maltose tạo thành là cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 1 nhân tố khảo sát, các nhân tố cịn lại được cố định. Chọn thơng số tối ưu và tiếp tục thay đổi các nhân tố cịn lại (Hình 3.6).
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 3.6: Sơ đồ bố thí thí nghiệm ảnh hưởng của pH đến quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác dụng của BSMA
Nhân tố F: Giá trị pH, thay đổi ở 5 mức độ
F1: 4,5 F2: 5 F3: 5,5 F4: 6 F5: 6,5
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 x 3 = 15
Tiến hành thí nghiệm:
Mẫu 5 g bột sắn dây được đem đi hồ hóa với nước theo tỷ lệ thích hợp ở nhiệt độ 90oC trong thời gian 30 phút. Hạ nhiệt độ dịch hồ tinh bột xuống giá trị thích hợp trước khi tiến hành đường hóa bằng enzyme β-amylase với các thơng số pH, thời gian và nồng độ enzyme đã tìm được.
Sau giai đoạn đường hóa tiến hành xử lý BSMA như sau: cho enzyme BSMA với nồng độ 10 U/g tinh bột vào dịch thủy phân trên và khảo sát giá trị pH thay đổi ở 5 mức
độ 4,5; 5; 5,5; 6 và 6,5. Sau khi điều chỉnh giá trị pH thích hợp bổ sung dung dịch đệm natri citrate theo tỷ lệ (1:1) vào nhằm mục đích cố định giá trị pH nhất định đồng thời tăng khả năng hoạt động cho enzyme BSMA. Quá trình thủy phân được thực hiện ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 4 giờ, bổ sung 10% maltodextrin để tăng hoạt tính của enzyme BSMA (dựa theo nghiên cứu của tác giả Chong-Hyo Choi và cộng sự, 2010)
Dịch thủy phân sau xử lý BSMA sẽ tạo ra các phức chất giữa puerarin và đường maltose, glucose. Chính vì thế, bổ sung enzyme γ-amylase để phân cắt các phức chất này thành puerarin và maltose, glucose tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định hàm lượng puerarin.
Vô hoạt enzyme BSMA trước khi bổ sung enzyme γ-amylase với nồng độ 60 U/g tinh bột trong thời gian 60 phút.
Tiếp tục vô hoạt enzyme γ-amylase, sau đó lọc và xác định hàm lượng puerarin có trong dịch đường sau thủy phân.
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng puerarin (mg/g)
3.3.2.6. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA đến quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose
a. Mục đích
Mỗi enzyme đều có khoảng nhiệt độ, thời gian và nồng độ thích hợp để hoạt động và cho hiệu suất cao. Thí nghiệm này nhằm xác định thời gian, nhiệt độ và nồng độ của enzyme BSMA để hàm lượng puerarin tạo thành là cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 nhân tố khảo sát, các nhân tố còn lại được cố định. Phương pháp bề mặt đáp ứng theo mơ hình Box-Behnken được sử dụng để xác định các thông số tối ưu của 3 nhân tố khảo sát (nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme). Mức độ của các nhân tố được thể hiện ở Bảng 3.5, sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.6.
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần Tổng số đơn vị thí nghiệm: 45
Bảng 3.5: Các nhân tố và mức độ khảo sát trong quá trình xử lý enzyme BSMA
Ký hiệu Nhân tố Đơn vị Mức độ
G Nhiệt độ °C Giờ U/g tinh bột 45 55 65 H Thời gian 2 4 6 I Nồng độ 10 15 20
Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken
STT Nhiệt độ (0C) Thời gian (giờ) Nồng độ (U/g tinh bột)
1 45 2 15 2 45 6 15 3 45 4 10 4 45 4 20 5 65 2 15 6 65 6 15 7 65 4 10 8 65 4 20 9 55 2 10 10 55 2 20 11 55 6 10 12 55 6 20 13 55 4 15 14 55 4 15 15 55 4 15 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ BSMA đến q trình biến tính hợp chất puerarin
Tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm được tiến hành tương tự thí nghiệm 4.
Sau khi xác định được giá trị pH thích hợp ở thí nghiệm 4, cho dung dịch đệm natri citrate theo tỷ lệ (1:1) vào nhằm mục đích cố định giá trị pH nhất định đồng thời tăng khả năng hoạt động cho enzyme BSMA. Trong quá trình thủy phân, bổ sung 10% maltodextrin để tăng hoạt tính của enzyme BSMA.
Thí nghiệm được tiến hành với 45 đơn vị thí nghiệm (Bảng 3.6) theo mơ hình Box- Behnken.
Vơ hoạt enzyme BSMA trước khi bổ sung enzyme γ-amylase với nồng độ 60U/g tinh bột trong thời gian 60 phút.
Tiếp tục vơ hoạt enzyme γ-amylase, sau đó lọc và xác định hàm lượng puerarin có trong dịch đường sau thủy phân.
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng puerarin (mg/g)
Nội dung 3: Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa có bổ sung phức chất puerarin-maltose
3.3.2.7. Thí nghiệm 6: Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của giống
Saccharomyces oviformis trong môi trường nước dứa – sắn dây ở giai đoạn