CHƯƠNG 3 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.3.2. Bố trí thí nghiệm
3.3.2.1. Phân tích thành phần hóa học của ngun liệu sắn dây a. Mục đích
Sắn dây là loại ngun liệu có thành phần dinh dưỡng phù hợp cho các sản phẩm lên men, tuy nhiên các thành phần này thường thay đổi theo điều kiện khí hậu, đất đai, vùng trồng. Vì vậy, việc phân tích các thành phần cơ bản của nguyên liệu trước khi tiến hành thí nghiệm là một điều rất cần thiết.
b. Các chỉ tiêu phân tích ‒ Độ ẩm ‒ Hàm lượng puerarin ‒ Hàm lượng đường tổng số ‒ Hàm lượng amylose ‒ Hàm lượng amylopectin ‒ Hàm lượng tinh bột
Nội dung 1: Tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase
3.3.2.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase
a. Mục đích
Xác định nồng độ cơ chất thích hợp cho q trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase để hàm lượng đường khử tạo thành là cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 1 nhân tố khảo sát, các nhân tố còn lại được cố định (Hình 3.3).
Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây
Nhân tố A: nồng độ cơ chất thay đổi ở 5 mức độ
A1: 8% A2: 10%
A3: 12% A4: 14%
A5: 16%
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 x 3 = 15
Tiến hành thí nghiệm:
Mẫu bột sắn dây tương ứng với các nồng độ khảo sát 8, 10, 12, 14 và 16%, pH 5,5 sẽ được đem đi hồ hóa với nước trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 90oC. Sau khi hồ hóa, dịch hồ tinh bột được hạ nhiệt độ xuống 60oC, thực hiện q trình đường hóa với việc bổ sung enzyme β-amylase ở nồng độ 20 U/g tinh bột, tiến hành đường hóa trong thời gian 2 giờ. Dịch thủy phân sau đường hóa sẽ được vơ hoạt enzyme ở nhiệt độ 90oC, 15 phút, sau đó lọc và xác định hàm lượng đường khử sinh ra.
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng đường khử.
3.3.2.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase
a. Mục đích
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 1 nhân tố khảo sát, các nhân tố cịn lại được cố định (Hình 3.4).
Nhân tố B: giá trị pH, thay đổi ở 5 mức độ:
B1 : 5 B2: 5,5
B3: 6 B4: 6,5
B5: 7
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 x 3 = 15
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của pH đến q trình thủy phân tinh bột sắn dây
Tiến hành thí nghiệm:
Mẫu 5 g bột sắn dây ứng với nồng độ cơ chất tìm được từ thí nghiệm 1 sẽ đem đi hồ hóa ở 90oC trong 30 phút. Thí nghiệm được tiến hành tương tự thí nghiệm 1 nhưng giá trị pH được thay đổi ở 5 mức độ 5 đến 7 (sử dụng dung dịch đệm để điều chỉnh pH dung dịch).
Dịch thủy phân sau đường hóa sẽ được vơ hoạt enzyme ở nhiệt độ 90oC, 15 phút, sau đó lọc và xác định hàm lượng đường khử sinh ra.
3.3.2.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme β-amylase đến q trình thủy phân tinh bột sắn dây
a. Mục đích
Xác định được giá trị nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme tối ưu để thu được hàm lượng đường khử cao nhất và đồng thời là cơ sở giúp các quá trình chế biến tiếp theo đạt hiệu suất cao.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 nhân tố khảo sát, các nhân tố còn lại được cố định. Phương pháp bề mặt đáp ứng theo mơ hình Box-Behnken được sử dụng để xác định các thông số tối ưu của 3 nhân tố khảo sát (nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme). Mức độ của các nhân tố được thể hiện ở Bảng 3.3, sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.4.
Bảng 3.3: Các nhân tố và mức độ khảo sát trong quá trình thủy phân tinh bột sắn dây
Ký hiệu Nhân tố Đơn vị Mức độ
C Nhiệt độ °C Giờ U/g tinh bột 45 55 65 D Thời gian 2 4 6 E Nồng độ 20 40 60
Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken
Số TT Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) (U/g tinh bột)Nồng độ
1 45 2 40 2 45 6 40 3 45 4 20 4 45 4 60 5 65 2 40 6 65 6 40 7 65 4 20 8 65 4 60 9 55 2 20 10 55 2 60 11 55 6 20 12 55 6 60 13 55 4 40 14 55 4 40 15 55 4 40
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ β-amylase đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây
Tiến hành thí nghiệm:
Mẫu 5 g bột sắn dây sau khi tìm được các giá trị thích hợp ở thí nghiệm 1 và 2 sẽ tiếp tục được khảo sát ảnh hưởng của các nhân tố nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme β- amylase tối ưu để hàm lượng đường khử sinh ra là cao nhất.
Thí nghiệm được tiến hành tương tự thí nghiệm 1 với 45 đơn vị thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken.
Dịch thủy phân sau đường hóa sẽ được vơ hoạt enzyme ở nhiệt độ 90oC, 15 phút, sau đó lọc và xác định hàm lượng đường khử sinh ra.
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng đường khử.
Nội dung 2: Tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose từ sắn dây và maltodextrin bằng enzyme maltogenic amylase
3.3.2.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác dụng của enzyme BSMA
a. Mục đích
Xác định được giá trị pH thích hợp để enzyme BSMA thể hiện hoạt tính tốt nhất sao cho hàm lượng phức puerarin-maltose tạo thành là cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 1 nhân tố khảo sát, các nhân tố còn lại được cố định. Chọn thông số tối ưu và tiếp tục thay đổi các nhân tố cịn lại (Hình 3.6).
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 3.6: Sơ đồ bố thí thí nghiệm ảnh hưởng của pH đến quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác dụng của BSMA
Nhân tố F: Giá trị pH, thay đổi ở 5 mức độ
F1: 4,5 F2: 5 F3: 5,5 F4: 6 F5: 6,5
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 x 3 = 15
Tiến hành thí nghiệm:
Mẫu 5 g bột sắn dây được đem đi hồ hóa với nước theo tỷ lệ thích hợp ở nhiệt độ 90oC trong thời gian 30 phút. Hạ nhiệt độ dịch hồ tinh bột xuống giá trị thích hợp trước khi tiến hành đường hóa bằng enzyme β-amylase với các thơng số pH, thời gian và nồng độ enzyme đã tìm được.
Sau giai đoạn đường hóa tiến hành xử lý BSMA như sau: cho enzyme BSMA với nồng độ 10 U/g tinh bột vào dịch thủy phân trên và khảo sát giá trị pH thay đổi ở 5 mức
độ 4,5; 5; 5,5; 6 và 6,5. Sau khi điều chỉnh giá trị pH thích hợp bổ sung dung dịch đệm natri citrate theo tỷ lệ (1:1) vào nhằm mục đích cố định giá trị pH nhất định đồng thời tăng khả năng hoạt động cho enzyme BSMA. Quá trình thủy phân được thực hiện ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 4 giờ, bổ sung 10% maltodextrin để tăng hoạt tính của enzyme BSMA (dựa theo nghiên cứu của tác giả Chong-Hyo Choi và cộng sự, 2010)
Dịch thủy phân sau xử lý BSMA sẽ tạo ra các phức chất giữa puerarin và đường maltose, glucose. Chính vì thế, bổ sung enzyme γ-amylase để phân cắt các phức chất này thành puerarin và maltose, glucose tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định hàm lượng puerarin.
Vô hoạt enzyme BSMA trước khi bổ sung enzyme γ-amylase với nồng độ 60 U/g tinh bột trong thời gian 60 phút.
Tiếp tục vô hoạt enzyme γ-amylase, sau đó lọc và xác định hàm lượng puerarin có trong dịch đường sau thủy phân.
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng puerarin (mg/g)
3.3.2.6. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA đến quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose
a. Mục đích
Mỗi enzyme đều có khoảng nhiệt độ, thời gian và nồng độ thích hợp để hoạt động và cho hiệu suất cao. Thí nghiệm này nhằm xác định thời gian, nhiệt độ và nồng độ của enzyme BSMA để hàm lượng puerarin tạo thành là cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 nhân tố khảo sát, các nhân tố còn lại được cố định. Phương pháp bề mặt đáp ứng theo mơ hình Box-Behnken được sử dụng để xác định các thông số tối ưu của 3 nhân tố khảo sát (nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme). Mức độ của các nhân tố được thể hiện ở Bảng 3.5, sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.6.
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần Tổng số đơn vị thí nghiệm: 45
Bảng 3.5: Các nhân tố và mức độ khảo sát trong quá trình xử lý enzyme BSMA
Ký hiệu Nhân tố Đơn vị Mức độ
G Nhiệt độ °C Giờ U/g tinh bột 45 55 65 H Thời gian 2 4 6 I Nồng độ 10 15 20
Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken
STT Nhiệt độ (0C) Thời gian (giờ) Nồng độ (U/g tinh bột)
1 45 2 15 2 45 6 15 3 45 4 10 4 45 4 20 5 65 2 15 6 65 6 15 7 65 4 10 8 65 4 20 9 55 2 10 10 55 2 20 11 55 6 10 12 55 6 20 13 55 4 15 14 55 4 15 15 55 4 15 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ BSMA đến q trình biến tính hợp chất puerarin
Tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm được tiến hành tương tự thí nghiệm 4.
Sau khi xác định được giá trị pH thích hợp ở thí nghiệm 4, cho dung dịch đệm natri citrate theo tỷ lệ (1:1) vào nhằm mục đích cố định giá trị pH nhất định đồng thời tăng khả năng hoạt động cho enzyme BSMA. Trong quá trình thủy phân, bổ sung 10% maltodextrin để tăng hoạt tính của enzyme BSMA.
Thí nghiệm được tiến hành với 45 đơn vị thí nghiệm (Bảng 3.6) theo mơ hình Box- Behnken.
Vô hoạt enzyme BSMA trước khi bổ sung enzyme γ-amylase với nồng độ 60U/g tinh bột trong thời gian 60 phút.
Tiếp tục vơ hoạt enzyme γ-amylase, sau đó lọc và xác định hàm lượng puerarin có trong dịch đường sau thủy phân.
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng puerarin (mg/g)
Nội dung 3: Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa có bổ sung phức chất puerarin-maltose
3.3.2.7. Thí nghiệm 6: Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của giống
Saccharomyces oviformis trong môi trường nước dứa – sắn dây ở giai đoạn nhân sinh khối
a. Mục đích
Nhằm xác định khả năng phát triển của nấm men Saccharomyces oviformis trong môi trường nước dứa-sắn dây. Đồng thời qua khảo sát có thể xác định được thời gian nhân giống thích hợp cũng như số lượng tế bào nấm men cần thiết để đưa vào lên men.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 2 nhân tố khảo sát (Hình 3.8). Nhân tố J: tỷ lệ nước dứa-sắn dây, thay đổi ở 5 mức độ
J1: 2:8 J2: 4:6 J3: 5:5 J4: 6:4 J5: 8:2
Nhân tố H: thời gian nhân giống, thay đổi ở 3 mức độ
K1: 24h K2: 48h K3: 72h
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm sự sinh trưởng và phát triển của giống nấm men S. oviformis theo thời gian
Tiến hành thí nghiệm:
Nước sắn dây sau khi được thủy phân bằng enzyme β-amylase và BSMA sẽ được bổ sung nước dứa với các tỷ lệ thay đổi ở 5 mức độ và tiến hành lọc, điều chỉnh các giá trị thích hợp cho q trình nhân giống:
pH 4,5-5,5 Pepton: 1% Bx: 15
Sau khi đã cân bằng dinh dưỡng như trên, tiến hành tiệt trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 30 phút và làm nguội đến nhiệt độ phòng. Dùng que cấy giống nấm men
S. oviformis từ ống thạch nghiêng vào bình tam giác 500 mL chứa mơi trường trên. Tiến
hành nhân giống ở nhiệt độ 28-32oC trong máy lắc ổn nhiệt.
Trong quá trình nhân giống, cứ sau 24 giờ lấy mẫu 1 lần kiểm tra số lượng tế bào nấm men trong 1 mL dịch nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi: số lượng tế bào nấm men/mL dịch nuôi cấy theo thời gian. Xác định
3.3.2.8. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phối chế nước dứa- nước sắn dây đến giá trị cảm quan của sản phẩm
a. Mục đích
Xác định được tỷ lệ phối chế thích hợp để tạo sản phẩm có nồng độ cồn thích hợp cũng như có giá trị cảm quan cao.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 1 nhân tố khảo sát, các nhân tố còn lại được cố định. Chọn thông số tối ưu và tiếp tục thay đổi các nhân tố cịn lại (Hình 3.9).
Đã thủy phân β - amylase
Hình 3.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ phối chế nước dứa-sắn dâyNhân tố L: tỷ lệ phối chế nước dứa-sắn dây, thay đổi ở 5 mức độ: Nhân tố L: tỷ lệ phối chế nước dứa-sắn dây, thay đổi ở 5 mức độ:
L1: 2:8 L2: 4:6
L3: 5:5 L4: 6:4
L5: 8:2
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 x 3 = 15.
Tiến hành thí nghiệm:
Dịch sắn dây sau giai đoạn thủy phân bằng enzyme β-amylase và BSMA sẽ được đem đi gia nhiệt ở 100oC trong 15 phút để dừng các phản ứng thủy phân bởi các enzyme trên đồng thời tiêu diệt các vi sinh vật gây hại có thể ảnh hưởng đến q trình lên men.
Sau khi gia nhiệt, dịch sắn dây được để nguội đến nhiệt độ phòng và tiến hành phối chế với nước dứa ứng với các tỷ lệ khảo sát sao cho thể tích cuối đạt được là 500 mL. Bổ sung dịch nấm men đã được ni cấy với thời gian thích hợp trong mơi trường dịch dứa-sắn dây (thí nghiệm 5) ở tỷ lệ 10%. Điều chỉnh Brix, pH với các giá trị tương ứng 20, 4,5 và tiến hành lên men ở nhiệt độ thường.
Cứ sau 1 ngày ghi nhận kết quả 1 lần, đến khi đạt độ cồn mong muốn (5-6o) thì dừng quá trình lên men.
Chỉ tiêu theo dõi:
Đánh giá cảm quan sản phẩm.
3.3.2.9. Thí nghiệm 8: Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa-sắn dây (khảo sát ảnh hưởng của pH, Bx, tỷ lệ nấm men) trong điều kiện lên men ở nhiệt độ thường
a. Mục đích
Tìm ra được các thơng số tối ưu cho nấm men phát triển giúp thu được hàm lượng cồn thích hợp nhất cũng như chất lượng cảm quan của sản phẩm là tốt nhất.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 nhân tố khảo sát (pH, Brix, tỷ lệ nấm men), các nhân tố cịn lại được cố định.
Hình 3.10: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến quá trình lên men
Mức độ của các nhân tố được thể hiện ở Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm được thực hiện theo mơ hình Box-Behnken với 3 nhân tố, 3 mức độ (Bảng 3.8).
Thí nghiệm được thực hiện 2 lần Tống số đơn vị thí nghiệm: 30 Bảng 3.7: Các nhân tố và mức độ khảo sát
M pH 3,5 4,5 5,5
N Bx 20 22 24
O Tỷ lệ nấm men % 5 10 15
Bảng 3.8: Bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-BehnkenSTT pH Bx Tỷ lệ nấm men (%) STT pH Bx Tỷ lệ nấm men (%) 1 3,5 20 10 2 3,5 24 10 3 3,5 22 5 4 3,5 22 15 5 4,5 20 5 6 4,5 20 15 7 4,5 22 10 8 4,5 22 10 9 4,5 22 10 10 4,5 24 5 11 4,5 24 15 12 5,5 20 10 13 5,5 24 10 14 5,5 22 5 15 5,5 22 15