CHƯƠNG 3 : PHƯƠNG TIỆN – PHƯƠNG PHÁP
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.3.1. Khảo sát bước sóng và nồng độ tinh bột thích hợp
nhàu trong phản ứng thủy phân tinh bột
3.2.3.1 Khảo sát bước sóng và nồng độ tinh bột thích hợp cho phản ứng thủy phân tinh bột thủy phân tinh bột
Thí nghiệm được tiến hành với tinh bột có nồng độ 20 mg/ml được pha trong dung dịch đệm phosphate 0,25 M, pH = 7 dựa theo nghiên cứu của Maher M. Al- Dabbas và ctv. (2006). Từ nồng độ tinh bột trên tiếp tục pha loãng trong dung dịch
Trọng lượng tươi – trọng lượng khô
x 100 (%) Trọng lượng tươi
đệm theo các nồng độ giảm dần như sau: 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 và 0,3125 mg/ml. Lần lượt lấy 450 μl tinh bột ở các nồng độ trên cộng thêm vào 450 μl dung dịch iod có nồng độ 5 mM - nồng độ dung dịch iod được chọn dựa theo nghiên cứu của Zhizhuang Xiao và ctv. (2007), hỗn hợp lúc sau được đo mật độ quang ở các bước sóng lần lượt là 450, 550, 580 và 660 nm.
3.2.3.2 Khảo sát độ hấp thụ các chất trong phản ứng thủy phân tinh bột bởi glucoamylase
Thí nghiệm được thực hiện như sau:
- Tinh bột có nồng độ 20 mg/ml được pha trong dung dịch đệm phosphate 0,25 M, pH = 7. Tiếp tục được pha loãng trong dung dịch đệm thành các nồng độ lần lượt là 10; 5; 2,5 mg/ml.
- Dung dịch iod được pha trong nước cất với nồng độ 5 mM, được pha loãng tiếp thành các nồng độ lần lượt là 2,5; 1,25 và 0,625 mM.
Các dung dịch tinh bột và iod với các nồng độ khác nhau sau khi pha được đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm.
3.2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH và thể tích enzyme trong phản ứng thủy phân tinh bột phân tinh bột
Thí nghiệm được tiến hành với enzyme ở nồng độ 1 mg/ml được pha trong dung dịch đệm phosphate 0,25 M với các pH lần lượt là 3; 4 và 5 để xác định pH mà ở đó hoạt độ của enzyme là cao nhất. Tinh bột có nồng độ 5 mg/ml được pha trong dung dịch đệm ở pH tương ứng với các pH của dung dịch đệm dùng để pha enzyme.
Lần lượt lấy 450 μl tinh bột được pha ở các pH khác nhau cho vào trong enzyme với cùng điều kiện pH đã ủ ở 37ºC trong 2 - 3 phút (thể tích enzyme cho vào lần lượt là 25 μl, 50 μl, 75 μl, 100 μl), ủ tiếp trong thời gian 7 phút, với 100 μl acid HCl (1 M) được thêm vào để dừng phản ứng tương tự như ở thí nghiệm trong nghiên cứu của Zhizhuang Ziao và ctv. (2007).
Sau khi phản ứng được dừng lại với HCl, lượng iod được cho vào bằng tổng thể tích của tinh bột và enzyme có trong từng phản ứng để nhận biết lượng tinh bột còn lại khi đo mật độ quang của phức hợp tinh bột - iod ở bước sóng 660 nm.
Chọn ra pH và thể tích enzyme thích hợp để sử dụng trong phản ứng thủy phân tinh bột về sau.
3.2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ủ enzyme trong phản ứng thủy phân tinh bột ứng thủy phân tinh bột
Tiến hành thí nghiệm với nồng độ enzyme 4 mg/ml được pha trong dung dịch đệm phosphate 0,25 M, pH = 5 và được tiếp tục pha loãng thành các nồng độ lần lượt là: 2; 1 và 0,5 mg/ml. Với 450 μl tinh bột (5 mg/ml) được cho vào trong 100 μl enzyme với các nồng độ khác nhau đã được ổn định ở nhiệt độ 37ºC trong 2 - 3 phút, thời gian để cho phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra theo các móc thời gian lần lượt từ 4 phút đến 11 phút, tại các móc thời gian khảo sát trong thí nghiệm phản ứng được dừng lại bằng cách cho vào 100 μl HCl (1 M).
Lượng tinh bột cịn lại sau phản ứng ở các móc thời gian khác nhau được nhận biết bằng cách cho tiếp 550 μl dung dịch iod có nồng độ 5 mM vào và đo mật độ quang của phức hợp tinh bột - iod ở bước sóng 660 nm.
3.2.3.5 Khảo sát khả năng ức chế enzyme glucoamylase của thuốc acarbose trong phản ứng thủy phân tinh bột trong phản ứng thủy phân tinh bột
Thuốc acarbose có nồng độ 26 mg/ml được pha trong dung dịch DMSO dùng làm dung dịch gốc sử dụng trong thí nghiệm. Từ nồng độ gốc của thuốc tiếp tục pha loãng trong dung dịch DMSO thành các nồng độ lần lượt là 0,615; 1,231; 2,462; 3,077; 4,000; 4,446; 5,000; 5,714; 6,665; 8,000 và 10,000 mg/ml.
Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme glucoamylase của thuốc acarbose được thực hiện bằng cách cho 100 μl dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau cho vào trong 100 μl enzyme được ủ ở 37ºC trong 2 - 3 phút, sau khi cho thuốc vào ủ với enzyme trong thời gian 10 phút một lượng tinh bột với thể tích 450 μl (5 mg/ml) được thêm vào ủ tiếp trong 7 phút, tạo điều kiện cho tinh bột có thể tác dụng với lượng enzyme cịn lại, với 550 μl dung dịch iod có nồng độ 5 mM được cho vào để phát hiện lượng tinh bột còn lại, nhằm để đánh giá lượng tinh bột cho vào có tác dụng được với enzyme hay không cũng như đánh giá lượng enzyme đã bị ức chế bởi tác động của thuốc acarbose khi đo mật độ quang của phức hợp tinh bột - iod ở bước sóng 660 nm.
Một nghiệm thức đối chứng âm tương ứng với lượng DMSO có trong từng nồng độ thuốc được cho vào trong 100 μl enzyme (2 mg/ml) được ủ ở 37ºC trong thời gian 2 - 3 phút, một lượng tinh bột với thể tích 450 μl ở nồng độ 5 mg/ml được cho thêm vào sau khi đã cho thuốc vào được 10 phút, hỗn hợp được ủ tiếp trong 7 phút để tinh bột có thể tác dụng được với một lượng enzyme còn lại sau phản ứng. Lượng tinh bột còn lại sau phản ứng được xác định sau khi cho tiếp 550 μl dung dịch iod vào và đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm.
Lượng tinh bột ban đầu cho vào trong phản ứng thủy phân được xác định bằng cách thực hiện tương tự như trên nhưng 100 μl dung dịch đệm phosphate 0,25M, pH = 5 được cho vào thay cho thể tích thuốc và cũng đo mật độ quang của phức hợp tinh bột - iod ở bước sóng 660 nm.
3.2.3.6 Khảo sát khả năng ức chế enzyme glucoamylase của cao chiết rễ nhàu trong phản ứng thủy phân tinh bột nhàu trong phản ứng thủy phân tinh bột
Cao chiết rễ nhàu có nồng độ 26 mg/ml được pha trong dung dịch DMSO làm dung dịch gốc cho thí nghiệm, tiếp tục pha loãng thành các nồng độ lần lượt là 0,08; 0,80; 1,60; 1,80; 2,00; 2,20; 2,40; 2,60; 2,89 và 5,2 mg/ml.
Tiến hành thí nghiệm với 100 µl dung dịch cao chiết ở các nồng độ khác nhau được cho vào trong 100 µl enzyme có nồng độ 2 mg/ml được ủ ở 37ºC trong 2 - 3 phút, hỗn hợp được ủ trong 10 phút, lấy 450 µl tinh bột ở nồng độ 5 mg/ml thêm vào trong phản ứng và được ủ tiếp trong thời gian 7 phút, sử dụng dung dịch iod ở nồng độ 5 mM với thể tích 550 µl cho vào trong hỗn hợp phản ứng, để phát hiện lượng tinh bột còn lại sau phản ứng khi đo mật độ quang của phức hợp giữa tinh bột và iod ở bước sóng 660 nm.
Nghiệm thức đối chứng dương với thuốc acarbose ở nồng độ 65 mg/ml pha trong dung dịch đệm phosphate được thực hiện tương tự như thí nghiêm với dung dịch cao chiết, với thể tích cao chiết cho vào trong phản ứng được thay bằng thuốc, các thành phần và điều kiện khác không thay đổi.
Nghiệm thức đối chúng âm với dung dịch DMSO được thực hiện tương tự như nghiệm thức đối chứng dương với thuốc acarbose nhưng 100 µl thuốc được thay bằng 100 µl dung dịch DMSO, các thành phần và điều kiện khác không thay đổi.
3.2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của ethanol đến khả năng ức chế enzyme glucoamylase của cao chiết rễ nhàu trong phản ứng thủy phân tinh bột
Nghiệm thức với ethanol (99º5)/dung dịch đệm phosphate 0,25 M, pH = 5 được thực hiện với 100 μl cao chiết ở các nồng độ (mg/ml) như phần thí nghiệm trên được pha trong dung dịch DMSO được cho vào trong 100 μl đệm/ethanol (99º5), hỗn hợp được ủ ở 37ºC trong 10 phút, một lượng tinh bột với thể tích 450 μl (5 mg/ml) được cho thêm vào và ủ tiếp trong 7 phút, sau đó 550 μl dung dịch iod (5 mM) được cho vào để phát hiện lượng tinh bột trong hỗn hợp phản ứng có tác dụng được với dung dịch cao chiết hay không khi đo mật độ quuang ở bước sóng 660 nm.
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Cao chiết rễ nhàu
Rễ nhàu sau khi rửa sạch với trọng lượng mẫu tươi là 2,5 kg được chặt nhỏ phơi đến khi trọng lượng không thay đổi, thu được mẫu khơ với trọng lượng cịn lại 175 g, ẩm độ 93% (được tính theo cơng thức được trình bày ở Phần 3.2.1). Mẫu rễ nhàu khơ được ngâm trong 3 lít ethanol (99º5), sau 48 giờ đem đi cô quay và thu được dạng cao thô. Cao chiết ethanol từ rễ nhàu được trữ ở 4ºC để chuẩn bị cho việc khảo sát hoạt tính ức chế hoạt động của enzyme glucoamylase trong phản ứng thủy phân tinh bột.
4.2 Bước sóng và nồng độ tinh bột thích hợp cho phản ứng thủy phân
Kết quả khảo sát bước sóng và nồng độ tinh bột thích hợp cho phản ứng thủy phân tinh bột được trình bày ở biểu đồ Hình 4.1.
Phức hợp của iod với các nồng độ TB theo các bước sóng
0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.1 2.4 2.7 3.0 3.3 3.6 0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20 Nồng độ tinh bột (mg/ml) Mật độ q uan g λ = 450 λ = 550 λ = 580 λ = 660
Hình 4.1: Biểu đồ mật độ quang của các nồng độ tinh bột và dung dịch iod (5 mM) ở các bước sóng (được pha lỗng 10 lần trước khi đo).
Từ biểu đồ Hình 4.1 cho thấy phức hợp của tinh bột và dung dịch iod (5 mM) có độ hấp thụ cao và được phát hiện tốt nhất khi được đo ở bước sóng 660 nm. Khi gia tăng nồng độ tinh bột tương ứng với lượng amylose có trong tinh bột cũng
sẽ gia tăng, phức hợp với iod được tạo ra càng nhiều vì vậy mật độ quang đo được cũng sẽ cao. Sử dụng bước sóng trong khoảng từ 550 - 660 nm để khảo sát mật độ quang của phức hợp giữa tinh bột-iod là tối ưu nhất, kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đây của Maher M. Al-Dabbas và ctv. (2006). Trong một nghiên cứu khác của Hazem M. N. Hassan (2010), trong thí nghiệm sử dụng tinh bột khoai tây hoặc amylose với dung dịch iod có nồng độ là 0,01 M, hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và được đo ở bước sóng 450 - 640 nm cho phức hợp giũa tinh bột khoai tây - iod và bước sóng 490 - 690 nm cho phức hợp giữa amylose - iod.
Kết quả thống kê Multifaction ANOVA cho thí nghiệm khảo sát bước sóng và nồng độ tinh bột thích hợp cho phản ứng thủy phân được trình bày ở phần Phụ lục 2.1. Từ kết quả thống kê cho thấy ở bước sóng 660 nm khác biệt khơng có ý nghĩa (p<0,05) so với bước sóng 550 và 580 nm và khác biệt có ý nghĩa so với bước sóng 450 nm. Kết quả thí nghiệm vẫn cho thấy phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đây vì vậy bước sóng 660 nm được chọn để khảo sát cho phản ứng thủy phân tinh bột của enzyme glucoamylase bằng cách đo độ hấp thụ của phức hợp giữa tinh bột - iod để xác định lượng tinh bột còn lại sau phản ứng khi cho dung dịch iod (5 mM) vào.
Tùy điều kiện cụ thể mà nhiều tác giả có thể chọn tinh bột ở nhiều nồng độ khác nhau để tiến hành thí nghiệm. Trong phần thí nghiệm này từ kết quả trên, nồng độ tinh bột cố định là 5 mg/ml được chọn trong phản ứng thủy phân tinh bột bởi enzyme glucoamylase vì ở nồng độ này khi kết hợp với dung dịch iod (hỗn hợp được pha loãng 10 lần rồi đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm) có giá trị ≤ 1,5, lượng tinh bột còn lại sau phản ứng thủy phân bởi enzyme glucoamylase sẽ kết hợp với dung dịch iod tạo nên phức có màu xanh đặc trưng và độ hấp thu đo được không vượt quá 1,5 điều này phù hợp với kết luận và nhận xét của Nair và Karki (1992). Ngoài ra, nếu chọn tinh bột có nồng độ càng cao thì sẽ có ảnh hưởng đến giá trị mật độ quang đo được, do tinh bột sau khi đun sẽ chuyển sang dạng hồ hóa và có gây cản quang vì vậy sẽ gây ảnh hưởng đến kết quả đo được, mật độ quang của các nồng độ tinh bột đo ở bước sóng 660 nm được trình bày trong phần Phụ lục Bảng 2.4. Từ Bảng 2.4 trong phần Phụ lục cũng cho thấy dung dịch iod ở
nồng độ 5mM khơng gây ảnh hưởng hoặc rất ít đến giá trị mật độ quang đo được trong phản ứng thủy phân tinh bột.
4.3 pH và thể tích enzyme thích hợp trong phản ứng thủy phân tinh bột
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và thể tích enzyme trong phản ứng thủy phân tinh bột được trình bày trong Bảng 4.1 với nồng độ enzyme được dùng trong thí nghiệm là 1 mg/ml, thời gian thủy phân là 7 phút ở nhiệt độ 37 ± 0,3ºC theo nhiệt độ cơ thể. Với cùng một điều kiện pH, nồng độ cơ chất khơng đổi, thể tích enzyme thay đổi. Dựa vào lượng tinh bột cịn lại sau phản ứng thủy phân để đánh giá khả năng thủy phân của enzyme, từ đó so sánh khả năng thủy phân tinh bột của enzyme trong các điều kiện pH khác nhau để chọn ra được pH tối ưu cho cho hoạt động thủy phân tinh bột của enzyme.
Bảng 4.1: Hiệu suất phản ứng thủy phân tinh bột (%) của enzyme ở các pH và thể tích khác nhau Thể tích enzyme (μl) pH 50 75 100 3 4 5 74,67 79,52 88,38 90,08 94,64 94,14 92,2 95,2 95,87
Từ kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy ở pH = 5, trong thời gian 7 phút 450 μl tinh bột bị thủy phân bởi 100 μl enzyme là nhiều nhất, với lượng tinh bột đã bị thủy phân là 95,87%. Vì vậy, thể tích enznyme được chọn cho phản ứng thủy phân 450 μl tinh bột cho các thí nghiệm về sau là 100 μl trong điều kiện pH = 5.
Tùy thuộc vào loại enzyme và nguồn gốc của enzyme mà nồng độ, tỉ lệ thể tích giữa enzyme và cơ chất là khác nhau trong từng phản ứng cụ thể. Trong một nghiên cứu của Rammohan Subramanian và ctv. (2008) tỉ lệ thể tích giữa enzyme và tinh bột được chọn trong phản ứng ức chế hoạt động α-glucosidase là 1:1.
Tiếp tục khảo sát hoạt độ của các nồng độ enzyme và thời gian ủ enzyme trong phản ứng thủy phân tinh bột, kết quả được trình bày ở Bảng 4.2.
Bảng 4.2: Mật độ quang trung bình theo nồng độ và thời gian ủ enzyme trong phản ứng thủy phân tinh bột ở bước sóng 660 nm
Thời gian (phút) 4 mg/ml 2 mg/ml 1 mg/ml 0,5 mg/ml 0 4 5 6 7 1,13480 0,12428 0,07365 0,05972 0,04911 1,13400 0,12856 0,09089 0,05785 0,04448 1,13280 0,68436 0,23863 0,19752 0,07298 1,12980 1,34823 1,25430 1,25819 1,32561
Kết quả Bảng 4.2 cho thấy enzyme ở nồng độ 4 mg/ml và 2 mg/ml có hoạt độ tốt nhất trong phản ứng thủy phân 450 μl tinh bột, lượng tinh bột bị thủy phân bởi 100 μl enzyme ở nồng độ 2 mg/ml là 96,08% trong thời gian 7 phút còn ở nồng độ enzyme 4 mg/ml lượng tinh bột bị thủy phân là 95,67%. Khi lượng enzyme và cơ chất thích hợp sẽ khơng xảy ra hiện tượng cạnh tranh giữa các phân tử enzyme tham gia phản ứng thủy phân thì quá trình thủy phân diễn ra sẽ nhanh hơn và lượng cơ chất có thể được thủy phân hồn tồn (Phạm Phước Nhẫn, 2009). Ở nồng độ enzyme 2 mg/ml trong thời gian 7 phút, 450 μl tinh bột bị thủy phân nhiều hơn so với enzyme ở nồng độ 4 mg/ml, có thể ở nồng độ 4 mg/ml của enzyme đã bắt đầu có sự cạnh tranh giữa các phân tử enzyme khi tham gia vào phản ứng thủy phân tinh bột nên lượng tinh bột bị thủy phân ít hơn so với nồng độ 2 mg/ml mặt