3.3.1. Môi trƣờng nảy mầm của hạt
Hạt đậu xanh của 8 giống được khử trùng (điều kiện khử trùng giống
như phần khử trùng hạt của mục 2.2.1) cấy trên môi trường nảy mầm, ở giai đoạn này hạt chủ yếu sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong hạt nên môi trường chưa cần cung cấp chất kích thích sinh trưởng. Ở cả 8 giống đậu xanh, sau một ngày nuôi cấy hạt bắt đầu nứt vỏ, 3 ngày hạt nảy mầm hoàn chỉnh.
Hình 3.9. Hạt đậu xanh nảy mầm sau 3 ngày (A, B), Hạt đậu xanh được tách ra để tạo đa chồi (C, D)
3.3.2. Môi trƣờng tạo đa chồi
Môi trường tạo đa chồi ở đa số các loài thực vật cần sử dụng các chất điều hoà sinh trưởng như IAA, BAP, IBA,…Trong quá trình thí nghiệm
A B
chúng tôi đã sử dụng BAP để tạo đa chồi ở đậu xanh. Việc sử dụng nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng thích hợp có ý nghĩa quan trọng đối với từng giai đoạn phát triển của cây, đây là nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào.
Sau 3 ngày, khi hạt nảy mầm dùng dao mổ tách hạt thành hai mảnh, dùng kim nhọn gây tổn thương ở mắt lá mầm, cấy các mảnh đó trong môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP với nồng độ khác nhau (1,5mg/l; 2mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l; 3,5mg/l). Mỗi bình cấy 10 – 15 mảnh lá mầm. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 lá mầm, lặp lại 3 lần.
Khả năng tạo chồi và số chồi / mảnh lá mầm được dùng để đánh giá khả năng thích ứng của giống và ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng trong hệ thống nuôi cấy in vitro, kết quả phân tích được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi ở đậu xanh
Công thức Nồng độ BAP Số chồi / một lá mầm
VN 93-1 VN99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 1,5 1,33 0,329 1,660,639 1,660,329 1,660,639 1,660,639 1,660,329 1,660,329 1,66 0639 2 2 1,660,639 2,330,329 2,000,577 2,330,329 1,660,329 2,330,086 2,000,57 2,300,639 3 2,5 1,670,329 2,300,375 2,660,329 2,430,352 2,350,144 2,660,144 2,500,144 2,330,202
4 3 2,330,329 2,660,329 3,000,577 2,660,329 2,660,639 3,350,259 3,150,329 3,000,577 5 3,5 1,330,329 1,670,329 1,330,329 1,570,190 1,660,329 2,330,329 1,480,069 1,330,369
Từ bảng 3.10 cho thấy sự khác biệt số lượng chồi từ mắt lá mầm môi trường tạo đa chồi bổ sung BAP với nồng độ 3 mg/l cho số chồi đạt tối đa trên một lá mầm dao động từ 2,33 0,329 đến 3,35 0,259 gặp ở tất cả 8
giống đậu xanh: VN93-1; VN99-1; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A; ĐX06. Số lượng chồi không chỉ phụ thuộc vào nồng độ BAP mà trong quá trình làm thí nghiệm mà chúng tôi còn thấy rằng, nếu gây tổn thương đúng vị trí, không quá sâu hay quá nông sẽ tạo được số chồi nhiều nhất. Cũng sử dụng lá mầm để tái sinh và môi trường tái sinh có bổ sung BAP nhưng nhóm nghiên cứu của Mai Trường và cs chỉ thu được số chồi tối đa là 3 chồi/lá mầm. Như vậy có thể kết luận rằng gây tổn thương mắt lá mầm đúng vị trí và môi trường tạo đa chồi bổ sung 3mg/l BAP tạo được số chồi / lá mầm là cao nhất.
Hình 3.10. Hình ảnh tạo đa chồi từ mắt lá mầm
3.3.3. Môi trƣờng kéo dài chồi
Sau khoảng 10 ngày khi chồi được hình thành, tách riêng từng chồi và cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi có bổ sung 1,5 mg/l GA3 và các chất dinh dưỡng khác nhau để cho chồi phát triển thuận lợi. Sau 10 ngày cấy trên môi trường kéo dài chồi, chồi đậu xanh đạt kích thước 4 - 5 cm được chuyển sang môi trường ra rễ.
Hình 3.11. Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3
3.3.4. Môi trƣờng ra rễ
Hệ rễ được hình thành khi chuyển các chồi sang môi trường ra rễ có bổ sung 0,3mg/l α – NAA, khoảng 30 ngày, khi cây hoàn chỉnh với bộ rễ phát triển tốt đạt chiều cao 7 – 8 cm, cây được chuyển ra ngoài nuôi cấy trong các khay.
Hình 3.12. Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α-NAA
3.3.5. Ra cây và chế độ chăm sóc
Khi cây con trong ống nghiệm có kích thước 5 - 7 cm với hệ rễ phát triển được đưa ra ngoài nuôi cấy trong khay (điều kiện nuôi cấy như phương pháp ra cây mục 2.2.1). Sau khoảng 30 ngày cây đậu xanh ra hoa và kết quả.
Hình 3.13. Cây đậu xanh tái sinh được trồng trong khay (A), Cây đậu xanh tái sinh được trồng trong chậu ra hoa kết quả (B, C, D)
3.3.6. Nhận xét về môi trƣờng tái sinh từ mắt lá mầm
(1). Môi trường bổ sung 3mg/l BAP và gây tổn thương đúng vị trí trí tạo được số lượng chồi / lá mầm là cao nhất.
(2) Môi trường bổ sung 1,5 mg/l GA3 sau 10 ngày nuôi cấy chồi tạo được chồi đạt kích thước cấy chuyển ra rễ tốt nhất.
(3) Cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng tạo đa chồi và tái sinh thành cây hoàn chỉnh, cây tái sinh đều có khả năng ra hoa kết quả khi trồng trong điều kiện trồng và chăm sóc trong khay.
A B
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Thăm dò môi trường nuôi cấy mô sẹo đậu xanh cho thấy: môi trường có bổ sung 11mg/l 2,4D là môi trường thích hợp cho tạo mô sẹo giống đậu xanh ĐX06. Môi trường có bổ sung 10mg/l 2,4D thích hợp cho tạo mô sẹo 7 giống còn lại. Nồng độ 3mg/l BAP cho tỷ lệ tái sinh, số chồi trung bình, kích thước trung bình chồi là cao nhất và môi trường có bổ sung 0,3mg/l α-NAA là thích hợp cho tạo cây hoàn chỉnh.
1.3. Đánh giá khả năng chịu mất nước của các giống đậu xanh ở mức độ mô sẹo trên cơ sở xác định độ mất nước, khả năng chịu mất nước, khả năng sống sót và khả năng tái sinh cây đã cho thấy cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng chịu mất nước ở mức độ mô sẹo. Đã chọn được 289 dòng mô chịu mất nước và 715 dòng cây xanh tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước.
1.3. Thăm dò môi trường tái sinh cây đậu xanh từ mắt lá mầmcho thấy, môi trường có bổ sung 3mg/l BAP và gây tổn thương đúng vị trí sẽ tạo được số chồi/ lá mầm cao. Môi trường có bổ sung 1,5 mg/l GA3 là môi trường tốt nhất để kéo dài chồi; môi trường bổ sung 0,3 mg/l α – NAA là môi trường thích hợp cho tạo rễ chồi đậu xanh.
1.4. Cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng tạo đa chồi từ mắt lá mầm và tái sinh thành cây hoàn chỉnh, có khả năng ra hoa kết quả khi trồng ra chậu.
2. Đề nghị
2.1. Tiếp tục sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc chọn dòng chịu hạn từ các giống đậu xanh nghiên cứu trên.
2.2. Cần có những nghiên cứu chuyển gen thích hợp để cải tiến các giống đậu xanh có chất lượng cao và khảnăng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường tốt.
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
Nguyễn Thị Luyện, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Lò Mai Thu, Chu Hoàng Mậu (2009), Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu xanh (Vigna radiata
(L.) Wilczek) phục vụ cho chuyển gen”. Tạp chí Khoa học&Công nghệ-Đại học Thái Nguyên, 54(6): 123-128.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Giáo trình cao học nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội (188 trang).
2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội.
3. Lê Trần Bình, Võ Thị Ngọc Diệp, Lê Thị Muội (1995), “Nghiên cứu khả năng chịu lạnh và chịu khô ở mô sẹo lúa của các giống lúa có nguồn gốc sinh thái khác nhau”, Tạp chí sinh học, 17(1), tr. 19 – 55.
4. Bùi Bảo Hoàn (1993), Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong bảo quản, nhân giống và chọn dòng chịu lạnh ở khoai lang (Ipomoea batatas L.), Luận văn thạc sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
5. Nguyễn Hữu Hồ và Nguyễn Văn Uyển (2005), Nghiên cứu hai kiểu tái sinh in vitro cây khoai lang Inpomoea Batatas, Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống ; NXB khoa học và kỹ thuật, 1242 – 1245.
6. Nguyễn Thị Thuý Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “Phát triển hệ thống tái sinh
in vitro ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill) phục vụ chuyển gen”. Tạp chí Khoa học&Công nghệ-Đại học Thái Nguyên, 52(4): 82-88.
7. Ngô Thị Liêm (2006),Nghiên cứu sự đa dạng di truyền và khả năng chịu hạn của một số giống lạc (Arachis hypogaea L.), Luận văn thạc sĩ sinh học, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên.
9. Nguyễn Hoàng Lộc (1992), Chọn dòng chịu muối NaCl và chịu mất nước ở thuốc lá (Nicotiana tabacum L.), luận án phó tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội, 107 trang.
10. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để
tạo các dòng đậu tương và đậu xanh đột biến đột biến thích hợp cho vùng núi đông bắc Việt Nam. Luận án tiến sĩ Sinh học. Viên Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
11. Nguyễn Thị Phương Nam và cộng sự (2007), “Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây ngô và ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen tạo protein giàu sắt
nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Những vấn đề cơ bản trong khoa
học sự sống, NXB Khoa học và kỹ thuật, 887 -89.
12. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
13. Nguyễn Thị Thanh và Võ Phan MiSa (2007), “Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro và ứng dụng chuyển gen ở hồ tiêu; Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, NXB Khoa học và kỹ thuật, 820 – 824.
14. Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội.
15. Phan Hữu Tôn (2004), Giáo trình Công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
16. Mai Trường, Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Văn Uyển (2001), “Hệ thống tái sinh cây đậu xanh từ cuống tử điệp nuôi cấy in vitro”. Tạp chí sinh học, 23: 33-35.
17. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên cứu thực nghiệm trong nông lâm ng nghiệp trên máy vi tính, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội
Tài liệu tiếng anh
18. Abdul B., Frinch R. P., Cocking E. C. (1999), Plant regeneration from protoplast of wild rice (Oryza rufipogon Griff)”, Plant cell Rep, 10, pp. 200 – 203
19. Adkins S. M., Shiraishi T., Kunavuvatchaidach R.,Godwin I. D. (1995), “Somaclonal variation in rice drought – tolerance and other agronomic characters”, Aust J Bot, 4, pp. 201 – 209.
20. Amutha S., Muruganantham M., and Ganapathi A. (2006), “Thidiazuron- induced high-frequency axillary and adventitious shoot regeneration in
Vigna radiata (L.) Wilczek”. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 42:26–30. 21. Bajai S., Rajam H. (1996), “Spermidine for effcient regeneration”, Rice Bio Quar, 26, pp. 6.
22.Bertin P., Kinet J. M. Bouharmont J. (1995), “Heritable chilling tolerance improvement in rice through somaclonal variation and cell line selection”,
Aust J Bot, 44, pp. 91 – 105.
23. Bertin P., Kinet J. M. Bouharmont J. (1997), “ Somaclonal variation and improvement of chilling tolerance in rice: Chance in chilling – induce chlorophyll fluorescence”, Crop Sci, 37, pp. 1727 – 1735.
24. Biwas G. C., Zapata F. J.(1993), “High – frequence plant regeneratin from protoplast of indica rice (Oryza sativa L.) using mantose”, J plant Physiol, 141, pp. 475.
NaCl tolerance cell from embryogenesis cultures of Pennisetum purpureum Schum”, Plant Sci Lett, 37, pp. 157- 164.
26. Collin H. A., Dix P.J. (1990), “Culture systems and selection procedure. In: Plant cell line selection. VCH Verlagsgesellschaft”.
27. Dix P.J (1986), Plant cell culture technology, Yeoman M.M. (eds), Oxford, Blackwel Scientific Publication, pp. 143 – 201.
28. Dix P.J.(1990), Plant cell line selection (Procedures and Applications), VCH Verlagsgllchaft MBH
29. Gulati A. and Jaiwal P.K. (1993). “In vitro selection of salt-resistant Vigna radiata (L.) Wilczek plants by adventitious shoot formation from cultured cotyledon explants”. J. Plant Physiol. 142: 99–10.
30. Gulati A, Jaiwal PK (1994), “Plant regeneration from cotyledonary node explants of mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek)”. Plant Cell Rep
13:523–527.
31. Ignacimuthu S. & Franklin G. (1999), “Regeneration of plantlets from cotyledon and embryonal axis explants of Vigna mungo L. Hepper”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 55: 75–78.
32. Jayanti Sen & Spra Guha Mukherjee (1998), “In vitro intoduction of multiple shoots and plant regeneration in Vigna, In vitro Cell.Dev. Biol. plant, 34: 276 – 280.
33. K. Ramakrishnan · R. Gnanam · P. Sivakumar A. Manickam, “In vitro
somatic embryogenesis from cell suspension cultures of cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp)”,Plant Cell Rep (2005) 24: 449–461.
34. Kaviraj C.P., G. Kiran, R.B. Venugopan, P.B.Kavi Kishor, Srinath Rao (2006), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from cotyredorary
explants of green gram (Vigna radiata (L.) Wilczek)- A recalcitrant grain legume”. In vitro Cell.Der. Biol. plant. 42: 134 – 138.
35. Mundy J., Chua N. H. (1988), Abcisis and water stress induce the expression of a novel rice gene”, EMBOJ, 8, pp. 2279 – 2286.
36.Muruganantham M., Amutha S.,Selvaraj N., Vengadesan G., Ganapathi A. (2007), “Efficient Agrobacterium- ediated transformation of Vigna mungo using immature cotyledonary-node explants and phosphinothricin as the selection agent”. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 43:550–557.
37. Norbor M. W. (1990), Environmental stress resistance. In: Plant Cell Line Selection, Weihein, New York, Basel, Cambridge, VCH, pp. 167 – 186.
38. Prem R. anand, Ganapathi A., Ramesh V. Anbazhagan, Gengadesan G., and Selvaraj N (2001), “High frequency plant regeneration via somatic embryogenesis in cell suspension cultures of cowpea, vigna unguiculata (L.) walp”. In VitroCell. Dev. Biol-Plant, 36:475-480.
39. Poddar K., Vishnoi R. K., Kothari S. L. (1998), “Plant regeneration from embryogenesis callus”, Rice Bio quar, 35, pp. 9.
40. Raghava. R. N. V., Nabors M. V., (1985), “Plant negeneration from tissue cultures of Pokali rice is promoted by optizing callus to medium volume ratio and by a medium conditioning factor produced by embryogeneic callus”, Cell Tiss Org Cult, 4, pp. 241 – 248.
41. Rudrabhatla Sairam, Siva Chennareddy, Madasamy Parani, Shulu Zhang, Diaa Al-abed, Wissam Abou-Alaiw, and Stephen Goldman (2005), “Obpc symposium: Maize 2004 & beyond – plant regeneration, gene discovery, and genetic engineering of plants for crop improvement”. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 41:411–423.
regeneration response from cotyledonary node explants in Asiatic Vigna species support genomic grouping within subgenus Ceratotropis (Piper) Verdc.” Plant Cell, Tissue and Organ Culture 58: 99–110.
43. Renato A Avenido, Jo Motoda and Kazumi Hattori (2001), “Direct shoot regeneration from cotyledonary nodes as a marker for genomic groupings within the Asiatic Vigna (subgenus Ceratotropis {Piper} Verdc.) species”.
Plant Growth Regulation, 35: 59–67.
44. Sita L. Mahala, T. Leela, B. Kiran Kumar, B. Naresh, Prathibha Devi (2006), “In vitro plant regeneration from the petioles of primary leaves of mungbean (Vigna radiata L.)”. Plant Biotechnology, 23: 409–411.
45. Sonia, Raman Saini, Rana P. Singh, Pawan K. Jaiwal (2007), “Agrobacterium tumefaciens mediated transfer of Phaseolusvulgaris - amylase inhibitor-1 gene into mungbean (Vigna radiata (L.)Wilczek) using bar as selectable marker”. Plant Cell Rep 26:187–198