Các chồi đậu xanh được tách thành một dòng cây và cấy chuyển trên môi trường tạo cây hoàn chỉnh. Nuôi 4 tuần dưới ánh sáng đền neon trong phòng nuôi cấy với cường độ 200 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phòng nuôi 250C 10C. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α - NAA: 0,3 mg/l; pH 5,6.
2.2.2.4. Phƣơng pháp ra cây
Cây nuôi cấy trong ống nghiệm là cây được sống trong điều kiện tối ưu về mọi mặt trong điều kiện môi trường vô trùng. Khi đưa cây ra ra ngoài ống nghiệm, cây phải chịu tác động của điều kiện bất lợi của môi trường. Do đó để đạt được cây có khả năng sống cao thì trong thời gian đầu mới đưa cây ra phải bảo vệ cẩn thận; từng bước cho cây làm quen dần với những điều kiện sống bên ngoài, cây con dần cứng cáp và phát triển được ở ngoài tự nhiên.
Các bước ra cây được tiến hành như sau:
- Các bình cây được mở nút, cho nước vào ngâm, sau đó lắc nhẹ cho thạch rời khỏi rễ cây, dùng panh cặp nhẹ kéo ra (chú ý tránh dập nát) rửa cẩn thận cho hết lớp agar bám quanh gốc bằng nước sạch.
- Chuẩn bị giá thể trồng cây: Đậu xanh kém chịu nước nên tỷ lệ đất: cát: trấu hun là 1:1,5:1,5. Giá thể trồng cây được đựng vào khay trồng với bề dày khoảng 10 cm.
- Trồng cây: cây con được trồng vào khay, sau đó dùng dung dịch MS cơ bản pha loãng 10 lần phun nhẹ nhàng vào gốc.
- Chăm sóc cây đậu xanh non: cây đậu xanh trồng trong khay để ra nơi đủ ánh sáng nhưng tránh nắng và tránh mưa trực tiếp. Sau 2 tuần cây sống ra rễ mới, lá mới có thể đưa ra ngoài vườn ươm.
2.2.3. Phƣơng pháp tạo đa chồi từ mắt lá mầm
Khử trùng hạt: hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó rửa bằng cồn 70% trong vòng một phút, lắc hạt với dung dịch javen 60% trong vòng 20 - 25 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng ba lần.
Môi trường nảy mầm hạt: Hạt đậu xanh đã được khử trùng cấy vào bình tam giác trong môi trường nảy mầm: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l; pH 5,8. Khảo sát khả năng nảy mầm của hạt, theo dõi sự phát triển và tỷ lệ nảy mầm.
Môi trường tạo đa chồi: Sau khi hạt nảy mầm dùng dao cắt bỏ phần trụ rễ cách phần mắt lá mầm khoảng 3- 4 mm. Tách đôi lá mầm thành 2 mẫu cấy, cắt bỏ lá mầm, dùng kim nhọn gây tổn thương ở mắt lá mầm. Các mảnh lá mầm được cấy trên môi trường tạo đa chồi: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7. Đánh giá tỷ lệ tạo chồi và số chồi / mảnh cấy.
Môi trường kéo dài chồi: các chồi được tách riêng và cấy vào môi trường kéo dài chồi: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; GA3 1mg/l; nước dừa 100ml/l; pH 5,7.
Môi trường ra rễ: Sau khi chồi có kích thước 4 - 5cm cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm có: MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l; nước dừa 100ml/l, α - NAA0,3mg/l.
Ra cây và chế độ chăm sóc: Cây tái sinh hoàn chỉnh được ra bầu và đưa ra trồng ở ngoài (phương pháp và điều kiện ra cây giống như mục phương pháp ra cây ở mục 2.2.2)
2.2.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số thống kê như trung bình mẫu (x), phơng sai (2), độ lệch chuẩn (), và sai số
trung bình mẫu (Sx), với n ≤ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [16].
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. HỆ THỐNG TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH TỪ MÔ SẸO
3.1.1. Ảnh hƣởng nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt
Hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm với cồn trong vòng một phút ở các thang nồng độ 60%; 70%; 80%; 90%. Sau đó được lắc nhẹ và đều trong dung dịch javen với nồng độ: 50%; 60%; 70% trong vòng 25 phút.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cồn 70% và javen 60% đảm bảo cho hạt nảy mầm cao, khả năng bị nhiễm và bị thối rất thấp. Nồng độ cồn và javen thấp tỷ lệ nhiễm cao; nồng độ cồn và javen cao tỷ lệ hạt bị thối cao.
3.1.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo
3.1.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi đậu xanh
Phôi đậu xanh sau khi khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 phôi, lặp lại 3 lần. Theo dõi khả năng hình thành mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.1. Kết quả bảng 3.1 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, phôi đậu xanh đều có khả năng tạo mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 11 mg/l 2,4D thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo của phôi giống đậu xanh ĐX06, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 100%. Còn ở môi trường có nồng độ 3mg/l – 10mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D cao hơn 11mg/l khả năng tạo mô sẹo của phôi đậu xanh ĐX06 bắt đầu giảm. Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, khả năng tạo mô sẹo giảm mạnh (79,50%). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148;
VC6372; VC2768A, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 99% khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l.
Bảng 3.1. Khả năng tạo mô sẹo của các giống đậu xanh (%)
Công thức
Nồng độ
2.4D (mg/l)
VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A
1 3 85,17 86,50 80,15 81,05 87,15 82,05 87,05 81,15 2 4 86,09 86,29 83,25 81,15 86,90 83,50 86,90 81,25 3 5 86,34 87,30 86,32 86,35 87,30 87,10 87,10 85,35 4 6 89,21 87,20 86,30 87,50 87,90 87,50 87,60 84,50 5 7 92,72 91,02 87,15 89,55 90,20 88,55 90,25 89,55 6 8 95,23 91,20 93,10 94,10 91,90 94,20 91,05 90,10 7 9 96,37 93,07 97,05 95,05 94,07 94,50 92,10 92,05 8 10 99,14 98,10 99,20 97,50 98,50 97,10 99,50 95,50 9 11 94,14 97,23 96,23 100,00 96,03 96,00 96,03 92,00 10 12 94,04 92,05 84,10 84,10 92,15 84,10 90,15 85,10 11 13 82,03 80,80 79,50 79,50 82,50 79,30 83,50 83,50
Ở môi trường có nồng độ 3 mg/l – 9 mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D cao hơn 10mg/l và khả năng tạo mô sẹo phôi đậu xanh của 7 giống trên đều giảm.
Đặc điểm hình thái của mô sẹo các giống đậu xanh được trình bày ở bảng 3.2. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, hình dạng mô sẹo cũng khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 8mg/l – 13mg/l 2,4D các mô sẹo đều có hình dạng sần sùi, nhưng nồng độ 2,4D từ 8mg/l -
10mg/l đối với 7 giống đậu xanh VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148;VC6372; VC2768A, các mô sẹo đó bó chặt còn nồng độ 2,4D cao hơn 10mg/l mô sẹo sần sùi nhưng không bó chặt. Đối với giống đậu xanh ĐX06 nồng độ 2,4D từ 8 mg/l – 11mg/l các mô sẹo có hình dạng sần sùi và bó chặt, còn nồng độ 2,4D cao hơn 11mg/l thì các mô sẹo đó không bó chặt lại. Nồng độ 2,4D từ 3 mg/l – 7mg/l tất cả các giống đậu xanh đều có hình dạng nhẵn.
Bảng 3.2. Hình dạng mô sẹo của các giống đậu xanh
Công thức Nồng độ 2,4D mg/l
VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A
1 3 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 2 4 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 3 5 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 4 6 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 5 7 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 6 8 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 7 9 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 8 10 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 9 11 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi
10 12 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 11 13 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi
Kết quả theo dõi tốc độ sinh trưởng của mô sẹo được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3. Tốc độ sinh trưởng mô sẹo của các giống đậu xanh (đvms) (1 đơn vị mô sẹo (đvms) có kích thước khoảng 3 mm2
)
Công thức
2.4-D
(mg/) VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 3 2,700,10 2,630,15 2,53 0,15 2,500,26 2,60 0,25 2,650,50 2,580,15 2,600,50 2 4 2,600,36 2,670,35 2,66 0,25 2,630,40 2,60 0,10 2,70 0,15 2,750,10 2,60 0,15 3 5 2,730,21 2,630,51 2,83 0,21 2,700,21 2,75 0,25 2,78 0,25 2,700,25 2,80 0,35 4 6 3,030,72 3,200,53 3,00 0,35 3,100,35 3,15 0,15 3,05 0,45 3,150,40 3,10 0,52 5 7 3,200,20 3,270,25 3,37 0,15 3,270,25 3,37 0,35 3,38 0,25 3,480,15 3,27 0,25 6 8 3,300,10 3,300,10 3,40 0,15 3,450,15 3,40 0,15 3,45 0,35 3,550,25 3,44 0,32 7 9 3,370,15 3,600,50 3,50 0,10 3,530,40 3,55 0,42 3,50 0,20 3,600,20 3,52 0,21 8 10 3,490,25 3,700,15 3,60 0,15 3,800,15 3,75 0,15 3,650,45 3,650,45 3,75 0,35 9 11 2,900,20 3,100,25 3,00 0,35 3,850,35 2,75 0,25 2,6 0,25 2,850,50 2,95 0,25 10 12 2,700,15 2,800,50 2,65 0,42 3,3 0,20 2,78 0,27 2,58 0,26 2,750,20 2,75 0,26 11 13 2,300,20 2,450,20 2,43 0,25 2,500,27 2,33 0,10 2,50 0,30 2,600,18 2,50 0,25
Bảng 3.3 cho thấy, sau 10 ngày nuôi cấy ở môi trường có nồng độ 3mg/l - 10 mg/l 2,4D mô sẹo của phôi giống đậu xanh ĐX06 có kích thước khối mô tăng dần và đạt kích thước lớn nhất ở môi trường có nồng độ 11mg/l 2,4D. Sử dụng 2,4D cao hơn 11mg/l kích thước mô sẹo của phôi đậu xanh ĐX06 bắt đầu giảm. Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, kích thước mô sẹo giảm mạnh (2,5 đvms). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A, các phôi nuôi cấy trong môi trường bổ sung từ 3 mg/l – 9 mg/l kích thước khối mô sẹo tăng dần và đạt cao nhất kích thước
lớn nhất khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l. Ở môi trường có nồng độ 2,4D cao hơn 10mg/l và kích thước mô sẹo phôi đậu xanh của 7 giống đó bắt đầu giảm dần.
Như vậy môi trường bổ sung nồng độ 2,4D 11mg/l thích hợp nhất với giống đậu xanh ĐX06 và nồng độ 2,4D cao hơn 10 mg/l đối với 7 giống đậu xanh còn lại, vì ở nồng độ đó tỷ lệ tạo mô sẹo, hình dạng cũng như kích thước mô sẹo là tốt nhất. Nồng độ 2,4D cao hơn tỉ lệ tạo mô sẹo và kích thước khối mô đều giảm. Sau một thời gian nuôi cấy ngắn, các mô sẹo này đều vàng và nhanh bị chết. Hiện tượng này cũng thường xuyên gặp khi nuôi cấy mô thực vật, có thể do khi nồng độ các chất sinh trưởng quá cao, thì sự phân chia tế bào xảy ra nhanh, sự định hướng cho sự biệt hoá cơ quan khó khăn nên các mô sẹo tạo ra dễ bị biến dạng. Hơn nữa khi nồng độ các chất sinh trưởng quá cao đặc biệt ở các loại mô sẹo hoặc chồi được cấy chuyển nhiều lần trên môi trường luôn duy trì các chất kích thích, các mẫu nuôi cấy này luôn tích tụ hàm lượng hoocmon ngoại sinh cao, dẫn đến các tế bào và mô dễ bị độc và nhanh chết. Còn nếu sử dụng nồng độ 2,4D thấp quá trình tạo mô sẹo và phát triển của mô sẹo rất chậm.
Mai trường và cs (2001) chỉ sử dụng BAP với nồng độ 4mg/l sau 1 tuần bắt đầu thấy sự hình thành các đám mô sẹo [16]. Kaviraj và cs (2006) tái sinh cây đậu xanh hoàn chỉnh từ mô sẹo đã sử dụng 2,4D trong giai đoạn tạo mô sẹo với nồng độ 9mg/l – 15mg/l và kết quả thu được với môi trường bổ sung 10mg/l 2,4D tạo 100% mô sẹo [34]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nhận được của nhóm Kaviraj và cs (2006). Như vậy môi trường bổ sung 11mg/l 2,4D là môi trường thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo phôi của giống đậu xanh ĐX06 và môi trường bổ sung 10mg/l 2,4D là môi trường thích hợp nhất cho khă năng tạo mô sẹo phôi đậu xanh của 7
giống còn lại, vì ở môi trường này tỉ lệ tạo mô sẹo và kích thước mô đều cao nhất.
Hình 3.1. Hìnhảnh mô sẹo phôi đậu xanh nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 2,4D
A:Mô sẹo phôi đậu xanh trên môi trường có bổ sung 10mg/l của giống đậu xanh VN93-1 B: Mô sẹo phôi đậu xanh trên môi trường có bổ sung 11mg/l của giống đậu xanh ĐX06
3.1.2.2. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh
BAP (6 - Benzyl amino purine) là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin. BAP ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hoá cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hoá chồi. BAP là chất có hiệu quả và sử dụng rộng rãi cho cảm ứng chồi trong cây họ đậu bao gồm cả đậu xanh (Gulati, Jaiwal, 1994) [20].
Mô sẹo thu được của các giống đậu xanh được chia thành những khối mô nhỏ có kích thước khoảng 3x3 mm, cấy lên môi trường MS cơ bản có chứa BAP với nồng độ khác nhau (2mg/l; 3mg/l; 4mg/l). Mỗi công thức được tiến hành trên 30 mô sẹo, lặp lại 3 lần. Sau đó theo dõi khả năng tái sinh cây của mô sẹo sau 10 và 15 ngày cấy chuyển.
Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh (%)
Công thức Nồng độ BAP (mg/)
VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A
Sau 10 ngày 1 2 60,2 2,5 61,03,5 66,0 2,5 63 4,0 60,01,5 63,0 5,0 65,0 1,5 60,0 4,1 2 3 98,6 1,2 88,02,1 77,3 1,1 87,0 2,4 77,52,5 75,8 1,5 82,7 2,5 86,8 2,5 3 4 63,31,5 64,02,0 62,0 3,5 63,0 1,5 61,5 1,5 60,5 4,5 61,5 4,0 63,1 2,5 Sau 15 ngày 1 2 65,2 1,5 66,03,0 67 2,1 63,53,5 62,0 1,0 66,0 1,0 67 1,8 66,0 3,8 2 3 99,0 1,0 90,01,9 78,0 1,2 88,0 1,8 78,5 1,5 77,0 1,5 84,7 2,5 87,0 2,5 3 4 65,52,5 66,02,8 63,0 2,5 64,0 1,5 65,0 1,5 63,0 2,5 63,5 3,0 64,1 1,5
Bảng 3.4 cho thấy, dưới ảnh hưởng của BAP thì tỉ lệ tái sinh cây của cả 8 giống đậu xanh khá cao sau 10 ngày, trong đó tỉ lệ tái sinh cây thấp nhất trên môi trường có nồng độ BAP 2 mg/l (60% - 66%) và cao nhất khi nồng độ BAP là 3 mg/l (77,3% - 98,6%). Bổ sung nồng độ BAP cao hơn (4mg/l) không làm tăng tỷ lệ tái sinh ở cây đậu xanh mà còn giảm tỷ lệ tái sinh (60,5% - 64,0%). Sau 15 ngày tỉ lệ tái sinh cây tăng lên không đáng kể. Các giống đậu xanh khác nhau tỷ lệ tái sinh cũng khác nhau. Tỷ lệ tái sinh cao nhất là giống VN93-1 (98,6% sau 10 ngày, 100% sau 15 ngày), giống VC6148 tỷ lệ tái sinh thấp nhất (75,8% sau 10 ngày, 77% sau 15 ngày). Sự
khác nhau này cho thấy cùng điều kiện môi trường nuôi cấy các giống khác nhau (kiểu di truyền khác nhau) khả năng tái sinh cũng khác nhau.
Khả năng tái sinh và số chồi/mô sẹo được dùng để đánh giá ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh của các giống đậu xanh nghiên cứu. Kết quả thí nghiệm tạo chồi được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi ở đậu xanh
Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Số chồi / một mô sẹo
VN 93-1 VN99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A
1 2 1,230,31 1,660,63 1,660,32 1,66 0,63 1,660,63 1,66 0,32 1,66 0,32 1,660,63 2 3 2,330,39 2,560,39 2,700,27 2,660,329 2,660,63 2,75 0,25 2,55 0,25 2.700,32 3 4 1,670,29 2,200,35 2,660,32 2,400,32 2,350,15 2,66 0,44 2,50 0,14 2,430,20
Sau 10 ngày tái sinh, số chồi/mô cao nhất đạt 2,75 chồi trên môi trường có bổ sung 3mg/l BAP. Môi trường bổ sung nồng độ BAP 2mg/l và 4 mg/l đều cho tỷ lệ tạo chồi thấp hơn. Kết quả cho thấy trong thí nghiệm của chúng tôi tỷ lệ tái sinh và số lượng chồi nhiều hơn so với báo cáo của Mai Trường