3.1.1. Ảnh hƣởng nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt
Hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm với cồn trong vòng một phút ở các thang nồng độ 60%; 70%; 80%; 90%. Sau đó được lắc nhẹ và đều trong dung dịch javen với nồng độ: 50%; 60%; 70% trong vòng 25 phút.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cồn 70% và javen 60% đảm bảo cho hạt nảy mầm cao, khả năng bị nhiễm và bị thối rất thấp. Nồng độ cồn và javen thấp tỷ lệ nhiễm cao; nồng độ cồn và javen cao tỷ lệ hạt bị thối cao.
3.1.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo
3.1.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi đậu xanh
Phôi đậu xanh sau khi khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 phôi, lặp lại 3 lần. Theo dõi khả năng hình thành mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.1. Kết quả bảng 3.1 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, phôi đậu xanh đều có khả năng tạo mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 11 mg/l 2,4D thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo của phôi giống đậu xanh ĐX06, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 100%. Còn ở môi trường có nồng độ 3mg/l – 10mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D cao hơn 11mg/l khả năng tạo mô sẹo của phôi đậu xanh ĐX06 bắt đầu giảm. Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, khả năng tạo mô sẹo giảm mạnh (79,50%). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148;
VC6372; VC2768A, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 99% khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l.
Bảng 3.1. Khả năng tạo mô sẹo của các giống đậu xanh (%)
Công thức
Nồng độ
2.4D (mg/l)
VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A
1 3 85,17 86,50 80,15 81,05 87,15 82,05 87,05 81,15 2 4 86,09 86,29 83,25 81,15 86,90 83,50 86,90 81,25 3 5 86,34 87,30 86,32 86,35 87,30 87,10 87,10 85,35 4 6 89,21 87,20 86,30 87,50 87,90 87,50 87,60 84,50 5 7 92,72 91,02 87,15 89,55 90,20 88,55 90,25 89,55 6 8 95,23 91,20 93,10 94,10 91,90 94,20 91,05 90,10 7 9 96,37 93,07 97,05 95,05 94,07 94,50 92,10 92,05 8 10 99,14 98,10 99,20 97,50 98,50 97,10 99,50 95,50 9 11 94,14 97,23 96,23 100,00 96,03 96,00 96,03 92,00 10 12 94,04 92,05 84,10 84,10 92,15 84,10 90,15 85,10 11 13 82,03 80,80 79,50 79,50 82,50 79,30 83,50 83,50
Ở môi trường có nồng độ 3 mg/l – 9 mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D cao hơn 10mg/l và khả năng tạo mô sẹo phôi đậu xanh của 7 giống trên đều giảm.
Đặc điểm hình thái của mô sẹo các giống đậu xanh được trình bày ở bảng 3.2. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, hình dạng mô sẹo cũng khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 8mg/l – 13mg/l 2,4D các mô sẹo đều có hình dạng sần sùi, nhưng nồng độ 2,4D từ 8mg/l -
10mg/l đối với 7 giống đậu xanh VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148;VC6372; VC2768A, các mô sẹo đó bó chặt còn nồng độ 2,4D cao hơn 10mg/l mô sẹo sần sùi nhưng không bó chặt. Đối với giống đậu xanh ĐX06 nồng độ 2,4D từ 8 mg/l – 11mg/l các mô sẹo có hình dạng sần sùi và bó chặt, còn nồng độ 2,4D cao hơn 11mg/l thì các mô sẹo đó không bó chặt lại. Nồng độ 2,4D từ 3 mg/l – 7mg/l tất cả các giống đậu xanh đều có hình dạng nhẵn.
Bảng 3.2. Hình dạng mô sẹo của các giống đậu xanh
Công thức Nồng độ 2,4D mg/l
VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A
1 3 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 2 4 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 3 5 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 4 6 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 5 7 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 6 8 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 7 9 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 8 10 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 9 11 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi
10 12 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 11 13 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi
Kết quả theo dõi tốc độ sinh trưởng của mô sẹo được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3. Tốc độ sinh trưởng mô sẹo của các giống đậu xanh (đvms) (1 đơn vị mô sẹo (đvms) có kích thước khoảng 3 mm2
)
Công thức
2.4-D
(mg/) VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 3 2,700,10 2,630,15 2,53 0,15 2,500,26 2,60 0,25 2,650,50 2,580,15 2,600,50 2 4 2,600,36 2,670,35 2,66 0,25 2,630,40 2,60 0,10 2,70 0,15 2,750,10 2,60 0,15 3 5 2,730,21 2,630,51 2,83 0,21 2,700,21 2,75 0,25 2,78 0,25 2,700,25 2,80 0,35 4 6 3,030,72 3,200,53 3,00 0,35 3,100,35 3,15 0,15 3,05 0,45 3,150,40 3,10 0,52 5 7 3,200,20 3,270,25 3,37 0,15 3,270,25 3,37 0,35 3,38 0,25 3,480,15 3,27 0,25 6 8 3,300,10 3,300,10 3,40 0,15 3,450,15 3,40 0,15 3,45 0,35 3,550,25 3,44 0,32 7 9 3,370,15 3,600,50 3,50 0,10 3,530,40 3,55 0,42 3,50 0,20 3,600,20 3,52 0,21 8 10 3,490,25 3,700,15 3,60 0,15 3,800,15 3,75 0,15 3,650,45 3,650,45 3,75 0,35 9 11 2,900,20 3,100,25 3,00 0,35 3,850,35 2,75 0,25 2,6 0,25 2,850,50 2,95 0,25 10 12 2,700,15 2,800,50 2,65 0,42 3,3 0,20 2,78 0,27 2,58 0,26 2,750,20 2,75 0,26 11 13 2,300,20 2,450,20 2,43 0,25 2,500,27 2,33 0,10 2,50 0,30 2,600,18 2,50 0,25
Bảng 3.3 cho thấy, sau 10 ngày nuôi cấy ở môi trường có nồng độ 3mg/l - 10 mg/l 2,4D mô sẹo của phôi giống đậu xanh ĐX06 có kích thước khối mô tăng dần và đạt kích thước lớn nhất ở môi trường có nồng độ 11mg/l 2,4D. Sử dụng 2,4D cao hơn 11mg/l kích thước mô sẹo của phôi đậu xanh ĐX06 bắt đầu giảm. Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, kích thước mô sẹo giảm mạnh (2,5 đvms). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A, các phôi nuôi cấy trong môi trường bổ sung từ 3 mg/l – 9 mg/l kích thước khối mô sẹo tăng dần và đạt cao nhất kích thước
lớn nhất khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l. Ở môi trường có nồng độ 2,4D cao hơn 10mg/l và kích thước mô sẹo phôi đậu xanh của 7 giống đó bắt đầu giảm dần.
Như vậy môi trường bổ sung nồng độ 2,4D 11mg/l thích hợp nhất với giống đậu xanh ĐX06 và nồng độ 2,4D cao hơn 10 mg/l đối với 7 giống đậu xanh còn lại, vì ở nồng độ đó tỷ lệ tạo mô sẹo, hình dạng cũng như kích thước mô sẹo là tốt nhất. Nồng độ 2,4D cao hơn tỉ lệ tạo mô sẹo và kích thước khối mô đều giảm. Sau một thời gian nuôi cấy ngắn, các mô sẹo này đều vàng và nhanh bị chết. Hiện tượng này cũng thường xuyên gặp khi nuôi cấy mô thực vật, có thể do khi nồng độ các chất sinh trưởng quá cao, thì sự phân chia tế bào xảy ra nhanh, sự định hướng cho sự biệt hoá cơ quan khó khăn nên các mô sẹo tạo ra dễ bị biến dạng. Hơn nữa khi nồng độ các chất sinh trưởng quá cao đặc biệt ở các loại mô sẹo hoặc chồi được cấy chuyển nhiều lần trên môi trường luôn duy trì các chất kích thích, các mẫu nuôi cấy này luôn tích tụ hàm lượng hoocmon ngoại sinh cao, dẫn đến các tế bào và mô dễ bị độc và nhanh chết. Còn nếu sử dụng nồng độ 2,4D thấp quá trình tạo mô sẹo và phát triển của mô sẹo rất chậm.
Mai trường và cs (2001) chỉ sử dụng BAP với nồng độ 4mg/l sau 1 tuần bắt đầu thấy sự hình thành các đám mô sẹo [16]. Kaviraj và cs (2006) tái sinh cây đậu xanh hoàn chỉnh từ mô sẹo đã sử dụng 2,4D trong giai đoạn tạo mô sẹo với nồng độ 9mg/l – 15mg/l và kết quả thu được với môi trường bổ sung 10mg/l 2,4D tạo 100% mô sẹo [34]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nhận được của nhóm Kaviraj và cs (2006). Như vậy môi trường bổ sung 11mg/l 2,4D là môi trường thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo phôi của giống đậu xanh ĐX06 và môi trường bổ sung 10mg/l 2,4D là môi trường thích hợp nhất cho khă năng tạo mô sẹo phôi đậu xanh của 7
giống còn lại, vì ở môi trường này tỉ lệ tạo mô sẹo và kích thước mô đều cao nhất.
Hình 3.1. Hìnhảnh mô sẹo phôi đậu xanh nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 2,4D
A:Mô sẹo phôi đậu xanh trên môi trường có bổ sung 10mg/l của giống đậu xanh VN93-1 B: Mô sẹo phôi đậu xanh trên môi trường có bổ sung 11mg/l của giống đậu xanh ĐX06
3.1.2.2. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh
BAP (6 - Benzyl amino purine) là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin. BAP ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hoá cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hoá chồi. BAP là chất có hiệu quả và sử dụng rộng rãi cho cảm ứng chồi trong cây họ đậu bao gồm cả đậu xanh (Gulati, Jaiwal, 1994) [20].
Mô sẹo thu được của các giống đậu xanh được chia thành những khối mô nhỏ có kích thước khoảng 3x3 mm, cấy lên môi trường MS cơ bản có chứa BAP với nồng độ khác nhau (2mg/l; 3mg/l; 4mg/l). Mỗi công thức được tiến hành trên 30 mô sẹo, lặp lại 3 lần. Sau đó theo dõi khả năng tái sinh cây của mô sẹo sau 10 và 15 ngày cấy chuyển.
Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh (%)
Công thức Nồng độ BAP (mg/)
VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A
Sau 10 ngày 1 2 60,2 2,5 61,03,5 66,0 2,5 63 4,0 60,01,5 63,0 5,0 65,0 1,5 60,0 4,1 2 3 98,6 1,2 88,02,1 77,3 1,1 87,0 2,4 77,52,5 75,8 1,5 82,7 2,5 86,8 2,5 3 4 63,31,5 64,02,0 62,0 3,5 63,0 1,5 61,5 1,5 60,5 4,5 61,5 4,0 63,1 2,5 Sau 15 ngày 1 2 65,2 1,5 66,03,0 67 2,1 63,53,5 62,0 1,0 66,0 1,0 67 1,8 66,0 3,8 2 3 99,0 1,0 90,01,9 78,0 1,2 88,0 1,8 78,5 1,5 77,0 1,5 84,7 2,5 87,0 2,5 3 4 65,52,5 66,02,8 63,0 2,5 64,0 1,5 65,0 1,5 63,0 2,5 63,5 3,0 64,1 1,5
Bảng 3.4 cho thấy, dưới ảnh hưởng của BAP thì tỉ lệ tái sinh cây của cả 8 giống đậu xanh khá cao sau 10 ngày, trong đó tỉ lệ tái sinh cây thấp nhất trên môi trường có nồng độ BAP 2 mg/l (60% - 66%) và cao nhất khi nồng độ BAP là 3 mg/l (77,3% - 98,6%). Bổ sung nồng độ BAP cao hơn (4mg/l) không làm tăng tỷ lệ tái sinh ở cây đậu xanh mà còn giảm tỷ lệ tái sinh (60,5% - 64,0%). Sau 15 ngày tỉ lệ tái sinh cây tăng lên không đáng kể. Các giống đậu xanh khác nhau tỷ lệ tái sinh cũng khác nhau. Tỷ lệ tái sinh cao nhất là giống VN93-1 (98,6% sau 10 ngày, 100% sau 15 ngày), giống VC6148 tỷ lệ tái sinh thấp nhất (75,8% sau 10 ngày, 77% sau 15 ngày). Sự
khác nhau này cho thấy cùng điều kiện môi trường nuôi cấy các giống khác nhau (kiểu di truyền khác nhau) khả năng tái sinh cũng khác nhau.
Khả năng tái sinh và số chồi/mô sẹo được dùng để đánh giá ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh của các giống đậu xanh nghiên cứu. Kết quả thí nghiệm tạo chồi được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi ở đậu xanh
Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Số chồi / một mô sẹo
VN 93-1 VN99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A
1 2 1,230,31 1,660,63 1,660,32 1,66 0,63 1,660,63 1,66 0,32 1,66 0,32 1,660,63 2 3 2,330,39 2,560,39 2,700,27 2,660,329 2,660,63 2,75 0,25 2,55 0,25 2.700,32 3 4 1,670,29 2,200,35 2,660,32 2,400,32 2,350,15 2,66 0,44 2,50 0,14 2,430,20
Sau 10 ngày tái sinh, số chồi/mô cao nhất đạt 2,75 chồi trên môi trường có bổ sung 3mg/l BAP. Môi trường bổ sung nồng độ BAP 2mg/l và 4 mg/l đều cho tỷ lệ tạo chồi thấp hơn. Kết quả cho thấy trong thí nghiệm của chúng tôi tỷ lệ tái sinh và số lượng chồi nhiều hơn so với báo cáo của Mai Trường và cs (2001) [15].
Từ kết quả nghiên cứu trên chúng tôi cho rằng nồng độ BAP 3mg/l là
Hình 3.2. Hình ảnh tái sinh đậu xanh trên môi trường bổ sung3mg/l BAP
3.1.2.3. Ảnh hƣởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của đậu xanh
GA3 (axit Gibberelic) là chất kích thích thuộc nhóm Gibberelin, nó tác động làm cho tế bào dãn ra và phân chia, làm tăng chiều cao của cây. Khi chồi đạt chiều cao 2 – 2,5 cm được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi có bổ sung GA3 với nồng độ : 0,5mg/l; 1mg/l;1,5mg/l; 2mg/l.
Kết quả cho thấy, sau 10 ngày cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi có bổ sung GA3 với nồng độ khác nhau đều làm cho chồi của đậu xanh dài ra. Nhưng trong 3 công thức nồng độ trên thì công thức môi trường bổ sung GA3 với nồng độ 1,5mg/l làm cho chồi đậu xanh được kéo dài và mập nhất, còn nồng độ GA3 0,5 mg/l và 1mg/l thì chồi kéo dài chậm hơn. Nồng độ GA3 2mg/l chồi kéo dài nhanh nhất nhưng cây yếu và sau một thời gian thì bị héo ngọn.
Hiện nay chưa thấy nghiên cứu nào nói về môi trường kéo dài chồi ở đậu xanh có sử dụng GA3, do vậy, từ kết quả thu được ở trên chúng tôi cho rằng nồng độ GA3 1,5 mg/l là tốt nhất cho kéo dài chồi ở đậu xanh.
Hình 3.3. Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3
3.1.2.4. Ảnh hƣởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh
α - NAA là chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin, có tác dụng mạnh đến quá trình hình thành và phát triển rễ thực vật. Để tạo rễ cây tái sinh chuẩn bị cho khâu tiếp theo là đưa ra ngoài đồng ruộng, chúng tôi đã nghiên cứu môi trường ra rễ cây đậu xanh nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản bổ sung α-NAA với các nồng độ khác nhau. Theo dõi khả năng tạo rễ của các cây tái sinh sau 3 tuần và 5 tuần cấy chuyển, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.6. Bảng 3.6 cho thấy, bổ sung α-NAA với các nồng độ từ 0,2 mg/l đến 0,4 mg/l đều giúp cho các chồi tạo rễ với tỉ lệ cao. Song nồng độ α-NAA cao thì tỉ lệ tạo rễ và chiều dài rễ phát triển càng kém đi. Môi trường có nồng độ α - NAA là 0,3 mg/l là môi trường thích hợp nhất cho sự ra rễ của đậu xanh, ở môi trường này tỉ lệ tạo ra rễ cao nhất (đạt 100%) và chiều dài rễ là cao nhất.
Từ kết quả thu được cho thấy ngoài việc sử dụng BAP để tạo rễ ở đậu xanh (Mai Trường và cs, 2001) [16] và sử dụng IAA kết hợp với α-NAA (Ignacimuthu và cs,1999) [31], chúng tôi chỉ sử dụng α-NAA bổ sung vào môi trường khả năng tạo rễ với tỷ lệ cũng cao (100%).
Bảng 3.6. Ảnh hưởng củ α-NAA tới khả năng ra rễ của cây tái sinh từ mô sẹo phôi đậu xanh
(tỷ lệ ra rễ của đậu xanh = số chồi ra rễ/ tổng sô chồi cấy chuyển (%))
Công thức
Nồng độ
α-NAA
VN 93-1 VC 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC2768A
Sau 3 tuần 1 0,2 75,674,5 71,03,0 68,74,3 68,74,3 60,54,5 63,04,0 66,53,5 65,0 2,5 2 0,3 98,61,4 97,0 1,1 97,0 1,4 97,0 1,4 97,52,5 97,51,5 94,72,5 96,8 2,0 3 0,4 72,3 2,7 64,0 4,0 64,0 2,5 64,0 2,5 61,01,5 60,52,5 61,54,5 63,1 5,0 Sau 5 tuần 1 0,2 85,5 1,5 76,03,0 68,74,3 73,53,5 68,01,0 69,01,0 70,01,5 76,0 3,8 2 0,3 99,0 1,0 98,0 1,9 97,0 1,4 98,0 1,8 98,51,5 98,01,5 94,72,5 97,0 2,5 3 0,4 65,5 2,5 66,0 2,0 64,0 2,5 64,0 1,5 65,01,5 63,02,5 63,53,0 64,5 1,5
3.1.3. Nhận xét về môi trƣờng tái sinh cấy cây đậu xanh từ mô sẹo
(1) Môi trường thích hợp nhất cho tạo mô sẹo của phôi đậu xanh là môi trường có bổ sung 10 mg/l 2,4D đối với các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A. Còn giống đậu xanh