Công nghệ sinh học hiện đại có khả năng tạo ra các protein tái tổ hợp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có y sinh học. Biểu hiện gen seb thành protein tái tổ hợp không độc phục vụ nghiên cứu tạo vaccine cũng được quan tâm nghiên cứu từ khá sớm. Năm 2002, Lee và cs đã nghiên cứu tạo vaccine tiềm năng phòng chống SEB dựa trên việc sử dụng hệ vector từ virus mang gen mã hóa SEB đột biến. Chuột sau khi tiêm vaccine này có khả năng chống lại được 5 liều trung bình SEB [24]. Tiếp đó, Woody và cs, (1997) đã nghiên cứu tạo được 2 loại protein SEB mang đột biến thay thế asparagine bằng lysine tại vị trí 23 (N23K) và phenylalanine bằng serine tại vị trí 44 (F44S) trên trình tự polypeptid SEB không độc. Theo đó, khi thử nghiệm 10µg SEB N23K và F44S (tương đương liều 30 LD50) đã không gây chết chuột thử nghiệm. Một điều thú vị là mặc dù protein SEB N23K và F44S thử nghiệm ở liều lượng thấp nhưng vẫn được phát hiện bởi phương pháp miễn dịch liên kết enzym ELISA nhờ kháng thể đa dòng kháng SEB. Sử dụng SEB tái tổ hợp N23K, F44S sẽ thúc đấy phản ứng kháng SEB bảo vệ 80 - 87% chuột [39]. Ngoài ra, Lowell và cs cũng đã nghiên cứu tạo được vaccine proteosome SEB có hiệu quả miễn dịch 100% cả trong cơ và trong thể dịch ở khỉ [25].
Swaminathan và cs (1992) đã nhận thấy những thay đổi nhỏ trên bề mặt phân tử SEB tại vị trí hoạt động rãnh 4α tạo ra các SEB không độc trong khi vẫn bảo thủ khả năng miễn dịch của phân tử [35]. Năm 1994, Thibodeau đã phân tích cấu trúc tinh thể SEB đột biến và tìm ra vị trí hoạt động gây nên triệu chứng nôn mửa gồm 14 axit amin nằm trong vùng từ axit amin 113 – 126 (rãnh α4). 14 axit amin này nối vùng 1 và 2 của phân tử SEB và trong 14 axit amin có 11 axit amin là giống nhau với mọi SEs [36].Tại rãnh α4 có từ 3 tới 5 vị trí có histidine (H32, H121, và H166) rất quan trọng cho các tế bào T (TCR - T Cell Receptor) bám vào. Năm 1982, Stelma và Bergdoll đã khá thành công trong nghiên cứu làm giảm độc tính của SEA và SEB bằng cách methyl hóa nhóm carboxyl ở các phân tử histidin trong cấu trúc protein SEB [33]. Vì tyrosine có cấu trúc gần giống histidine nên thay thế histidine
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tích điện dương bằng tyrosine ưa nước sẽ không làm thay đổi cấu trúc bề mặt phân tử, do đó có thể thay thế việc methyl hóa nhóm carbonxyl của histidine ở thí nghiệm trên. Các phân tử SEA, SEB khi được methyl hóa nhóm carbonxyl của các histidine không những có thể làm giảm độc tính của các kháng nguyên mà còn bảo tồn được khả năng gây miễn dịch của chúng [33, 28]. Dựa trên cơ sở đó, năm 2003, Korolev và cs đã nghiên cứu tạo 4 đột biến điểm thay thế các axit amin histidine bởi các tyrosine tại 4 vị trí có codon mã hóa cho histidine (codon 12; 32; 105 và 121). Tác giả Savransky và cs sau đó 1 năm (2004) cũng khẳng định SEB mang 4 đột biến thay thế histidine bằng tyrosine tại vị trí các codon 12; 32; 105 và 121 đã tạo ra một kháng nguyên tái tổ hợp không mang độc tố, và có khả năng kích ứng ở mức độ cao các kháng thể IgG đặc hiệu [22, 31, 32].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid
Tế bào vi khuẩn khả biến Escherichia coli chủng DH5α và BL21(DE3) được sử dụng cho mục đích tách dòng và biểu hiện protein SEB, vector tách dòng GS45350 mang đoạn gen mã hóa cho protein SEB đã được gây đột biến và vector pET21a+ (Novagen) được sử dụng làm vector biểu hiện protein tái tổ hợp do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.1.2. Các bộ kít
- Kít tinh sạch ADN (AccuPrep® Gel Purification Kit) (Bioneer, Hàn Quốc) - Kít tách chiết plasmid (Plasmid Extraction Kit) (Bioneer, Hàn Quốc)
2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị
- Hóa chất: Bacto pepton, yeast extract, NaCl, agarose, glucose, trypton, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, ethanol 70%, các dung dịch đệm muối phosphate, nước khử ion. Kháng sinh ampicillin và các loại hóa chất thông dụng khác (ethidium bromide, .v.v.), các loại enzym cắt giới hạn (EcoRI,
HindIII), Taq ADN polymerase và Pfu turbo ADN polymerase được mua từ các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
- Máy móc và thiết bị: Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi ADN (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Pulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.1.4. Môi trƣờng và đệm
Môi trường cho vi khuẩn và các loại đệm sử dụng trong nghiên cứu được chuẩn bị theo Sambrook và cs (1998) hoặc theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.1.5. Cặp mồi sử dụng
Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này để tạo các điểm cắt của hai enzym giới hạn là EcoRI và HindIII ở hai đầu đoạn gen mã hoá cho protein SEB (đã được gây đột biến thay thế nucleotide nhằm mục đích loại bỏ tính độc của protein này): mSEB-F và mSEB-R.
2.1.6. Phần mềm
Thiết kế mồi, và dữ liệu trình tự ADN được xử lý bằng phần mềm Lasergene version 7 của DNASTAR Inc., Mỹ; BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., 1990); BioEdit version 7 (Tom Hall, Department of Microbiology , North Carolina State University, NC) và Primer3 Input Version 4 [42].
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.1.Sơ đồ các bước thí nghiệm
2.2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Nguyên lý:
Kỹ thuật tổng hợp ADN nhân tạo cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép ADN trong tế bào vi sinh vật như: Đoạn ADN cần được mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi xuôi, ngược, cần nguyên liệu và điều kiện môi trường thích hợp và enzym ADN polymerase. Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (94oC) để biến tính chuỗi ADN sợi kép, kết hợp với enzym Taq ADN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động. Kỹ thuật PCR nhân bản lượng lớn ADN chỉ với một lượng nhỏ ADN ban đầu.
Tiến hành:
- Sau khi đo nồng độ ADN khuôn , tính và tạo các nồng độ ADN của các m ẫu như nhau để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích ADN khuôn được giống nhau , và đạt khoảng 50ng trong tổng thể tích là 25µl/ 1 phản ứng.
- Tính lượng thể tích các thành phần khác trong phản ứng , trộn đều các thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn ADN.
- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy. Phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần như sau:
Phản ứng PCR được thực hiện với chu kì nhiệt như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng 16 Dung dịch đệm (10X) 2.5 dNTPs (10mM) 2 Primer mSEB-F (100ng/µl) 1,25 Primer mSEB-R (100ng/µl) 1,25
Taq ADN polymerase hoặc Pfu
turbo ADN polymerase (2.5u/µl ) 1
Vector GS45350/SEB (50 ng/µl) 1 Tổng thể tích 25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.1. Chu kì phản ứng PCR
2.2.2.2. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)
Nguyên lý:
Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR cũng dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, chỉ khác ở mẫu ADN được thay thế bằng ADN plasmid được giải phóng từ khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao 94oC đến 95oC, màng tế bào bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu, hoặc mồi vector.
Tiến hành:
Hòa tan tế bào vi khuẩn trong 25µl nước khử ion. Sau đó sử dụng 5µl hỗn hợp này để dùng cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR được thực hiện như mô tả tại mục 2.2.2.1.
2.2.2.3. Phƣơng pháp xử lý enzym hạn chế
Nguyên lý:
Enzym hạn chế là các nuclease nội bào (endonuclease) có khả năng nhận biết và cắt các đoạn ADN tại các vị trí với trình tự nucleotide nhất định. Trong nghiên cứu này hai enzym hạn chế EcoRI và HindIII được sử dụng với các mục đích bao Bước Phản ứng Nhiệt độ (o
C) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 94 3 phút 2 Biến tính 94 30 giây 3 Gắn mồi 55 30 giây 30 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 45 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
gồm: i) để tạo đầu cắt so le cho gen seb sau khi đã được nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector tách dòng GS45350; ii) để mở vòng vector biểu hiện pET21a+ để sử dụng cho phản ứng kết nối với gen seb; iii) để kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) sau khi được chuyển vector này. Về nguyên tắc thành phần phản ứng cắt enzym hạn chế không khác nhau, điểm khác nhau chỉ có là thể tích của các thành phần sẽ được điều chỉnh thích hợp với mỗi mục đích và ADN mẫu.
Tiến hành:
Phản ứng cắt mở vòng vector pET21a+ được thực hiện với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng Đệm R (10X)
Enzym EcoRI (10u/µl) Enzym HindIII (10u/µl) Plasmid pET 21a+ Tổng thể tích 4 1,5 1 1 7,5 15
Phản ứng tạo đầu cắt so le cho gen seb sau khi đã được nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector tách dòng GS45350 được thực hiện với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng Đệm R (10X)
Enzym EcoRI (10u/µl) Enzym HindIII (10u/µl) Sản phẩm PCR Tổng thể tích 12 5 1,5 1,5 30 50
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) thực hiện với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng Đệm R (10X)
Enzym EcoRI (10u/µl) Enzym HindIII (10u/µl) Vector pET 21a+/SEB Tổng thể tích 2 1 1 1 5 10
Thành phần phản ứng được trộn đều và tiến hành trong 2 giờ ở nhiệt độ 37oC, sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
2.2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch ADN từ gel agarose
Nguyên lý:
Phương pháp này được áp dụng để tinh sạch đoạn ADN quan tâm từ bản điện di trên gel agarose. Trong trường hợp này, đoạn gen seb sau khi được nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector GS45350 sẽ được tinh sạch để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu. Trong phương pháp này phân tử ADN quan tâm sẽ được giữ lại trên cột tinh sạch có bản chất là các hạt sepharose, sau đó sử dụng đệm để thu lại các phân tử ADN này. Thông qua phương pháp này mẫu ADN sẽ đủ tinh sạch để tiến hành các phản ứng khác như xử lý enzym hạn chế hay kết nối với vector.
Tiến hành:
- Cắt vùng gel chứa đoạn ADN quan tâm trên bản điện di.
- Cân đoạn gel vừa cắt được và xác định thể tích đoạn gel này theo quy ước 1mg trọng lượng sẽ tương đương với 1 µl thể tích.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Bổ sung dịch kết gắn ADN vào cột tinh sạch GB (Gel Binding), theo tỉ lệ: Vmẫu:VGB = 1:3.
- Ủ hỗn hợp ở 60oC trong 10 phút và cứ 2 phút thì đảo nhẹ 1 lần cho đến khi gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết ADN và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Tiếp tục bổ sung đệm rửa 500µl WB (Washing Buffer), ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm thêm 1 lần nữa trong vòng 1 phút để loại đệm WB.
- Chuyển cột sang ống Eppendorf mới 1,5ml. Bổ sung 30-50µl nước khử ion khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút để thu mẫu ADN.
2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector
Nguyên lý:
T4 ligase xúc tác tạo liên kết phosphatdieste bằng cách liên kết đầu 5’ phosphat trong phân tử ADN hoặc ARN này với đầu 3’ hydroxyl của phân tử ADN hoặc ARN kia do vậy mà có thể nối 2 sợi ADN hoặc ARN khác nhau. Vector biểu hiện tái tổ hợp được thiết kế bằng cách ghép đoạn gen seb và plasmid pET21a+ sau khi đã xử lý bởi hai enzym giới hạn là EcoRI và HindIII.
Tiến hành:
- Tính nồng độ vector và nồng độ mẫu ADN trong trường hợp nối đầu so le (tỉ lệ về số mol giữa vector : đoạn seb chèn là 1:4)
- Tính các thành phần còn lại cho 1 phản ứng và mix phản ứng.
Phản ứng kết nối đoạn ADN vừa tinh sạch vào vector tách dòng được thực hiện trong hỗn hợp sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nước khử ion Đệm T4 ligase (10X) Gen seb (100ng) Plasmid pET21+ (20ng) Enzym T4 ligase (1u/1µl) Tổng thể tích 2 2 12 2 2 20
Phản ứng kết nối được thực hiện trong 2 giờ ở nhiệt độ 22oC. Sau khi kết thúc, hỗn hợp được dùng để biến nạp hoặc lưu giữ ở tủ -20oC.
2.2.2.6. Phƣơng pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào vi khuẩn Escherichia coli DH5α
Nguyên lý:
Biến nạp là quá trình chuyển ADN trực tiếp vào tế bào nhận, những tế bào có khả năng tiếp nhận ADN được gọi là tế bào khả biến. Quá trình này gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp.
Tiến hành:
- Bổ sung 1µl ADN plasmid vào ống tế bào khả biến (50 - 100µl). - Để ổn định trong đá trong vòng 15 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong vòng 90 giây sau đó để trong đá 15 phút.
- Bổ sung 400µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 220 v/p trong vòng 1giờ, 37oC.
- Cấy trải 100 - 150µl trên môi trường thạch LB chứa ampicillin. - Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC qua đêm.
2.2.2.7. Phƣơng pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn Escherichia coliDH5α
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phương pháp tách chiết ADN plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn và biến tính các phân tử protein. Khi thay đổi pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch có chứa kali acetat, các phân tử protein và ADN hệ gen sẽ bị kết tủa, tách ra khỏi dung dịch bằng ly tâm tốc độ cao. ADN plasmid được tủa lại bằng ethanol 100% hoặc isopropanol. Lượng ARN còn tồn tại trong dung dịch chứa ADN plasmid được loại bỏ bằng cách bổ sung RNase.
Tiến hành:
- Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào Eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.
- Thêm 100µl dung dịch Sol I (50 mM gluco, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA (pH 8)), hoà tan cho cặn tan hoàn toàn.
- Bổ sung 200µl dung dịch Sol II (0,2N NaOH; 1% SDS (trọng lượng/thể tích: w/v)), đảo nhẹ.
- Thêm 150µl dung dịch Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml nước), đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút.