Gen seb đột biến được đưa vào vector GS45350 không chứa đoạn mã hóa hai enzym cần thiết cho quá trình kết nối với vector biểu hiện pET21a+ là EcoRI và
HindIII (Hình 3.2.). Chính vì vậy, điểm cắt của hai enzym này được bổ sung bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi chứa hai điểm nhận biết của EcoRI và HindIII. Trình tự mồi này được thiết kế dựa trên trình tự gen seb đột biến với các thông số được thể hiện ở bảng 3.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.1. Trình tự cặp mồi nhân bản đoạn gen seb đột biến từ vector GS45350.
Mồi Trình tự mồi Tỉ lệ
G-C (%)
Tm (0C) mSEB - F 5’- GGGGAATTCATGGAGAGTCAACCA - 3’ 50 61.8 mSEB - R 5’- CCCCAAGCTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGC
TTTTTCTTTG - 3’ 53,7
80.8
Trình tự 2 mồi được thiết kế thêm các điểm cắt của enzym hạn chế EcoRI (GAATTC) và HindIII (AAGCTT) (được kí hiệu đậm và có gạch chân trên bảng 3.1) xuôi chiều với promotor của 2 vector và nằm sát ngay các bộ ba tận cùng của đoạn gen. Hai enzym này sẽ tạo những đầu cắt so le phù hợp tại vector biểu hiện và gen đích, đồng thời làm giảm khả năng tự đóng vòng khi phải mở vòng vector. Vì
EcoRI và HindIII là các enzym hạn chế có hoạt tính mạnh nên cần có 1 trình tự bao ngoài điểm cắt của các enzym. Do đó, trong trình tự mồi chúng tôi thiết kế có trình tự GGG và CCC nằm tại 2 đầu mút của mồi.
Trình tự mồi xuôi còn chứa codon khởi đầu (ATG), trình tự mồi ngược không chỉ có codon kết thúc (TCA) đánh dấu điểm cuối của gen đích mà còn chứa trình tự His-taq (GTG GTG GTG GTG GTG GTG) có ý nghĩa trong quá trình tinh sạch protein đích sau này. Cả 2 mồi đều được thiết kế 1 đoạn trình tự bổ sung với 2 đoạn trình tự đầu và cuối của gen seb tái tổ hợp.
Với thiết kế như trên chúng tôi sẽ nhân được nguyên vẹn chiều dài đoạn gen và giữ đúng khung đọc thông suốt khi đưa vào vector biểu hiện pET21a+ từ vị trí mở đầu trên vector, thông qua đoạn gen seb, 6 axit amin histidine và kết thúc ở bộ ba kết thúc.