Theo thiết kế vector biểu hiện pET21a+/SEB, khi protein SEB được tổng hợp, nó sẽ nối thêm 6 axit amin Histidin ở phần - COOH. Đây là một đặc điểm thuận lợi cho việc tinh sạch sản phẩm, đồng thời cũng là một tín hiệu để nhận biết sản phẩm được tổng hợp bằng Western blot. Trong thí nghiệm này chúng tôi tinh sạch trực tiếp thu protein SEB dựa trên những kết luận về điều kiện cảm ứng ở trên. Sau quá trình biểu hiện, các tế bào được được phá vỡ bằng sóng siêu âm và tiến hành ly tâm 13000 vòng trong 15 phút để tách riêng pha cặn và pha dịch. Kiểm tra trên gel polyacylamide thấy protein SEB biểu hiện ở dạng hòa tan đủ lượng thì tiến hành tinh sạch (hình 3.15).
Hình 3.15. Điện di kiểm tra protein SEB dạng tan trước khi tinh sạch. 1: Protein tổng số trong pha cặn; 2: Protein tổng số mẫu đối chứng (-) không cảm ứng IPTG; M:
Thang protein chuẩn; 4: Protein tổng số trong pha dịch
Phương pháp tinh sạch bằng cột HisTrap dựa vào liên kết ái lực giữa ion niken (Ni2+) với vòng imidazol của histidin. Khi các axit amin histidin ở gần nhau thì liên kết giữa chúng với các ion niken càng mạnh. Protein tái tổ hợp do gen seb mã hoá có đuôi His - tag với 6 axit amin histidin liên tục sẽ liên kết đặc hiệu với ion niken.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Các phân tử protein trong tế bào được tổng hợp ra do không có đuôi His - tag sẽ không gắn được với ion niken. Mặt khác các ion niken trong cột lại được liên kết với các hạt Sepharose bằng một phức càng cua nên protein tái tổ hợp sẽ không bị rửa trôi bằng các đệm rửa như các protein khác. Protein tái tổ hợp được giữ lại trên cột sẽ được tách ra khi cho qua dung dịch đệm có chứa nồng độ imidazol thích hợp. Việc thu mẫu được tiến hành theo từng phân đoạn liên tục để kiểm tra protein ngoại lai bắt đầu tách ra khỏi cột từ phân đoạn nào và kết thúc ở phân đoạn nào. Trong quá trình tinh sạch và thu mẫu protein trên chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm trước và sau khi tinh sạch trên gel polyacrylamide 12%. Kết quả tinh sạch protein SEB sau 5 giờ cảm ứng 1mM IPTG, ở nhiệt độ 28oC được thể hiện trong hình 3.16.
Hình 3.16. Điện di kết quả tinh sạch protein SEB tái tổ hợp. M: Thang protein chuẩn; 1: Đối chứng (-): Không cảm ứng IPTG; 2: Cảm ứng IPTG; 3 Phân đoạn Flow; 4: Phân đoạn
Washing; 5-Protein sau tinh sạch
Kết quả trên điện di đồ cho thấy, sản phẩm tinh sạch chỉ có một băng protein duy nhất với trọng lượng khoảng 28 kDa tương đương trọng lượng của băng biểu hiện trước khi tinh sạch. Chúng tôi kiểm tra các phân đoạn thu mẫu khác nhau. Từ phân đoạn thứ 2 bắt đầu thu được protein ngoại lai và đến phân đoạn thứ 6 thì hầu như không thấy xuất hiện nữa. Như vậy chúng tôi đã thu được hoàn toàn lượng protein ngoại lai tinh sạch.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
KẾT LUẬN
1. Thiết kế thành công vector biểu hiện mang gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin B đã được gây đột biến loại độc tính.
2. Đã xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu để tăng khả năng biểu hiện protein staphylococcal enterotoxin B đột biến ở dạng tan trong tế bào vi khuẩn
Escherichia coli chủng BL21(DE3) là ở các điều kiện: nhiệt độ 28oC, nồng độ IPTG 1mM và thời gian cảm ứng là 5 giờ.
3. Tinh sạch thành công protein staphylococcal enterotoxin B đột biến để sử dụng làm nguyên liệu tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng Staphylococcus aureus trong thực phẩm.
KIẾN NGHỊ
1. Kiểm tra độc tính của protein staphylococcal enterotoxin B đột biến trên đối tượng thử nghiệm (chuột hoặc thỏ)
2. Xác định nồng độ protein staphylococcal enterotoxin B, chuẩn bị nguồn nguyên liệu cho việc tạo kháng thể đơn dòng để chế tạo kít chuẩn đoán nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố tụ cầu vàng gây ra ở giai đoạn sau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I - Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Thị Huyền, Bùi Hồng Vân, Văn Thị Như Ngọc, Trương Văn Dung, Trương Nam Hải (2009), Biểu hiện gen ha5 mã hoá kháng nguyên Hemagglutinin (HA) của virus cúm A/H5N1 trong Escherichia coli, Tạp chí Công nghệ sinh học, 7(2), 185-192.
2. Đông Phương (2008), Đề phòng ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng, http://news.restaurants.com.vn/?page=tintuc&code=home&id=587.
3. Lâm Quốc Hùng (2009), Phòng chống ngộ độc tại Việt Nam năm 2008, dự báo và giải pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm năm 2009, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, http://vfa.gov.vn/news.asp?ID=21322.
4. Lê Huy Chính (2003), Vi sinh y học, Nxb Y học, Hà Nội.
5. Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thanh Yến, Phan Thị Kim, Nguyễn Thị Sợt, Nguyễn Thị Khánh Sâm (2005), Tình hình ô nhiễm vi khuẩn và nhận thức vệ sinh an toàn thực phẩm ở người kinh doanh thức ăn đường phố. Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, www.vfa.gov.vn.
6. Nguyễn Thị Liên Hạnh, Huỳnh Hồng Quang (2009), Các nguyên nhân gây bệnh ỉa chảy nhiễm khuẩn do Tụ cầu vàng và Virus, http://www.impe- qn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=2745.
II - Tài liệu tiếng Anh
7. Baba T., Bae T., Schneewind O., Takeuchi F., Hiramatsu K. (2008), Genome sequence of Staphylococcus aureus strain Newman and comparative analysis of staphylococcal genomes: polymorphism and evolution of two major pathogenicity islands, J. Bacteriol, 190(1), 300-310.
8. Baba T., Takeuchi F., Kuroda M., Yuzawa H., Aoki K., Oguchi A., Nagai Y., Iwama N., Asano K., Naimi T., Kuroda H., Cui L.,Yamamoto K., Hiramatsu K.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(2002), Genome and virulence determinants of high virulence community- acquired MRSA, Lancet, 359(9320), 1819-1827.
9. Bean N. H., Griphin P. M., Goulding J. S., Ivey C. B. (1990), Foodborne disease outbreaks, 5 year summary, 1983-1987, J. Food Prot, 53, 711-728.
10.Bergdoll M. S. (1989), Staphylococcus aureus, Foodborne Bacterial Pathogens (Doyle, M.P., ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA, 463-523.
11.Bruce A. G., Kermit D. H. (2009), CBRNE - Staphylococcal Enterotoxin B, http://emedicine.medscape.com/article/830715-overview.
12.CAST (1994), CAST Report: Foodborne Pathogens: Risks and Consequences, Task Force Report No. 122, Washington, DC: Council for Agricultural Science and Technology.
13.Christopher L. J., Saleem A. K. (1986), Nucleotide Sequence of the Enterotoxin B Gene from Staphylococcus aureus, Journal of bacteriology, 166(1), 29-33. 14.Evenson M. L., Hinds M. W., Bernstein R. S., Bergdoll M. S. (1988),
Estimation of human dose of staphylococcal enterotoxin A from a large outbreak of staphylococcal food poisoning involving chocolate milk, Int. J. Food Microbiol, 7, 311-316.
15.Gill S. R., Fouts D. E., Archer G. L., Mongodin E. F., Deboy R. T., Ravel J., Paulsen I. T., Kolonay, J. F., Brinkac L., Beanan M., Dodson R. J., Daugherty S. C., Madupu R., Angiuoli S. V., Durkin A. S., Haft D. H., Vamathevan J., Khour I. H., Utterback T., Lee C., Dimitrov G., Jiang L., Qin H., Weidman J., Tran K., Kang K., Hance I. R., Nelson K. E., Fraser C. M. (2005), Insights on evolution of virulence and resistance from the complete genome analysis of an early methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain and a biofilm-producing methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis strain, J. Bacteriol, 187, 2426-2438.
16.Greenfield R. A., Brown B. R., Huntchins J. B., Iandolo J. J., Jackson R., Slater L. N., Bronze M. S. (2002), Microbiological, biological, and chemical weapons
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
of warfare and terrorism, The American Journal of the Medical Science, 323(6),
326-340.
17.Haeghebaert S., Le Q. F., Gallay A., Bouvet P., Gomez M., Vaillant V. (2002), Les toxi-infections alimentaires collectives en France, en 1999 et 2000, Bull. Epidémiol. Hebdo, 23, 105-109.
18.Herron O. L., Fitzgerald J. R., Musser J. M., Kapur V. (2007), Molecular correlates of host specialization in Staphylococcus aureus, PLoS ONE, 2(10), E1120.
19.Holden M. T.,Feil E. J., Lindsay J. A., Peacock S. J., Day N. P., Enright M. C., Foster T. J., Moore C. E., Hurst L., Atkin R.,Barron A., Bason N., Bentley S. D., Chilling W. C., Chilling W.T., Churcher C., Clark L., Corton C., Cronin A.,Doggett J., Dowd L., Feltwell T., Hance Z., Harris B., Hauser H.,Holroyd S., Jagels K., James K. D., Lennard N., Line A., Mayes R.,Moule S., Mungall K., Ormond D., Quail M. A., Rabbinowitsch E., Rutherford K., Sanders M., Sharp S., Simmonds M., Stevens K.,Whitehead S., Barrell B. G., Spratt B. G., Parkhill J. (2004), Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(26), 9786-9791.
20.Huang L. Y., Bergdoll M. S. (1970), The primer structure of staphylococcal enterotoxin B, J. Biol. Chem, 245, 3518-3525.
21.Kọferstein F. K., Motarjemi Y., Bettcher D. W. (1997), Foodborne disease control: a transnational challenge, Emerging Infect, Dis, 3, 503-510.
22.Korolev S., Pinelis D., Savransky V., Komisar J., Vogel P., Fegeding K. (2003), Toxicity of the staphylococcal enterotoxin B mutants with histidine-to-tyrosine substitutions, Toxicology,187(2/3), 229–238.
23.Kuroda M., Ohta T., Uchiyama I., Baba T., Yuzawa H., Kobayashi I., Cui L., Oguchi A., Aoki K., Nagai Y., Lian J., Ito T., Kanamori M., Matsumaru H., Maruyama A., Murakami H., Hosoyama A., Mizutani U. Y., Takahashi N. K.,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sawano T., Inoue R., Kaito C., Sekimizu K., Hirakawa H., Kuhara S., Goto S., Yabuzaki J., Kanehisa M., Yamashita A., Oshima K., Furuya K., Yoshino C., Shiba T., Hattori M., Ogasawara N., Hayashi H., Hiramatsu K. (2001), Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus Aureus, Lancet, 357(9264), 1225-1240.
24.Lee J. S., Dyas B. K., Nystrom S. S., Lind C. M., Smith J. F., Ulrich R. G. (2002), Immune protection against staphylococcal enterotoxin-induced toxic shock by vaccination with Venezuelan equine encephalitis virus replicon, J. Infect. Dis, 185, 1192-1196.
25.Lowell G. H., Colleton C., Frost D., Kaminski R. W., Hughes M., Hatch J., Hooper C., Estep J., Pitt L., Topper M., Hunt R. E., Baker W., Baze W. B. (1996), Immunogennicity and efficacy agains lethal aerosol staphylococcal enterotoxin B challenge in monkeys by intramuscular and respiratory delivery of proteosome – toxoid vaccines, Infect. Immun, 64(11), 4686-4693.
26.Nema V., Agrawal R., Kamboj D. V., Goel A. K., Singh L. (2007), Isolation and characterization of heat resistant enterotoxigenic Staphylococcus aureus from a food poisoning outbreak in Indian subcontinent, Int. J. Food Microbiol, 117(1), 29-35.
27.Ono H. K., Omoe K., Imanishi K., Iwakabe Y., Hu D. L., Kato H. (2008), Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins, types S and T, Infect Immun, 76(11), 4999-5005.
28.Reck B., Scheuber P. H., Londong W., Sailer-Kramer B., Bartsch K., Hammer D. K. (1988), Protection against the staphylococcal enterotoxin-induced intestinal disorder in the monkey by anti-idiotypic antibodies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(9), 3170-3174.
29.Rosec J. P., Gigaud O. (2002), Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France, Int. J. Food Microbiol, 77, 61-70.
30.Rosec J. P., Guiraud J. P., Dalet C., Richard N. (1997), Enterotoxin production by staphylococci isolated from foods in France, Int. J. Food Microbiol, 35, 213-221.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
31.Savransky V., Pinelis D., Korolev S., Ionin B., Fegeding K. (2004), Immunogenicity of the histidine-to-tyrosine staphylococcal enterotoxin B mutant protein in C3H/HeJ mice, Toxicon, 43, 433–438.
32.Savransky V., Rostapshov V., Pinelis D., Polotsky Y., Korolev S., Komisar J., Fegeding K. (2003), Murine lethal toxic shock caused by intranasal administration of staphylococcal enterotoxin B, Toxicol. Pathol, 31(4).
33.Stelma G. N., Bergdoll M. S. (1982), Inactivation of staphylococcal enterotoxin A by chemical modification, Biochem. Biophys. Res. Commun, 105(1), 121-126.
34.Steven R. G., Derrick E. F., Gordon L. A. (2005), Insights on Evolution of Virulence and Resistance from the Complete Genome Analysis of an Early Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strain and a Biofilm-Producing Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis Strain, J Bacteriol, 187(7), 2426–2438. PMCID: PMC1065214.
35.Swaminathan S., Furey W., Pletcher J., Sax M. (1992), Crystal structure of staphyloccocal enterotoxin B, a superantige, Nature, 359, 801 – 806.
36.Thibodeau J., Cloutier I., Lavoie P. M., Labrecque N., Mourad W., Jardetzky T., Sekaly R. P. (1994), Subsets of HLA-DR1 molecules defined by SEB and TSST-1 binding, Sciences, 266(5192), 1874-1878.
37.Wallace D. J., Van G. T., Shallow S., Fiorentino T., Segler S. D., Smith K. E., Shiferaw B., Etzel R., Garthright W. E., Angulo F. J. and the Food Net Working Group. (2000), Incidence of Foodborne Illnesses Reported by the Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet)-1997, J. Food Prot, 63, 807-809. 38.Wieneke A. A., Roberts D., Gilbert R. J. (1993), Staphylococcal food poisoning
in the United Kingdom, 1969-90, Epidemiol. Infect,110, 519-531.
39.Woody M. A., Krakauer T., Stiles B. G. (1997), Staphylococcal enterotoxin B mutants (N23K and F44S): biological effects and vaccine potential in a mouse model, Vaccine, 15, 133-139.
40. Yarwood J. M., McCormick J. K., Paustian M. L., Orwin P. M., Kapur V., Schlievert P. M. (2002), Characterization and expression analysis of
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
staphylococcus aureus pathogenicity island 3. Implications for the evolution of staphylococcal pathogenicity islands, J. Biol. Chem, 277(15), 13138-13147. 41.Yves L. L., Florence B., Michel G. (2003), Staphylococcus aureus and food
poisoning, Genet. Mol. Res, 2(1), 63-76.
III - Tài liệu internet
42.http://frodo.wi.mit.edu/primer3/
43.http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/dai-cuong-an-toan-thuc-pham.271194.html 44.http://vi.wikipedia.org/wiki/Cơ_chế_độc_lực_của_vi_khuẩn
45.http://vi.wikipedia.org/wiki/Tụ_cầu_khuẩn 46.http://www.uniprot.org/uniprot/P01552