2.1.1.Quy trình chung Nƣớc thải Lõi bắp Nƣớc Bắp Hấp Làm nguội Rửa sạch Bào mỏng Lọc Gieo men Lên men Men Bã bắp Rƣợu bắp Hãm cồn Rƣợu gạo
a/Nguyên liệu
Bắp đƣờng đƣợc mua ở chợ Nguyễn Tri Phƣơng. Rƣợu gạo đƣợc mua từ nhà máy rƣợu Bình Tây. b/Nguồn giống
Sử dụng men ngọt đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp truyền thống. Men đƣợc mua ở chợ Nguyễn Tri Phƣơng.
c/Cách tiến hành quy trình thí nghiệm
Ngun liệu bắp đƣờng đƣợc rửa sạch nhằm loại bỏ đất cát, lá và râu bắp cịn sót lại. Sau đó, bắp đƣờng đƣợc bào mỏng bằng dao bào để quá trình hấp diễn ra nhanh hơn và nấm men đƣợc tiếp xúc nhiều hơn với bắp giúp thuận lợi cho quá trình lên men.
Bắp sau khi bào mỏng đƣợc đem đi hấp ở nhiệt độ 100oC trong 1 giờ. Trong q trình hấp, tinh bột bắp đƣợc hồ hóa giúp cho enzyme dễ dàng thủy phân tinh bột.
Sau khi hấp, bắp đƣợc làm nguội về nhiệt độ phịng (28oC) vì nhiệt độ của bắp sau khi hấp rất cao nếu cho nấm men vào sẽ giết chết nấm men hoặc làm giảm khả năng lên men của nấm men. Để làm bắp mau nguội, ta trải bắp ra khay.
Bắp sau khi làm nguội ta tiến hành gieo men: men đƣợc nghiền mịn và rải đều vào bắp. Trong lúc gieo men luôn đảo đều tay để men đƣợc tiếp xúc đều hồn tồn với bắp để q trình lên men tối ƣu.
Sau quá trình lên men (120 giờ), nồng độ cồn của rƣợu bắp khoảng 8,5%v/v. Với nồng độ cồn thấp nhƣ vậy rất dễ bị oxy hóa tiếp để tạo thành CO2 và H2O với sự có mặt của nhóm vi khuẩn acetic nên chúng tơi tiến hành hãm cồn (thêm cồn tinh khiết) sau q trình lên men vừa tránh oxi hóa cồn vừa tăng độ cồn cho rƣợu bắp.
Lọc hỗn hợp lên men qua vải lọc nhằm thu hồi dung dịch rƣợu, có thể ép chặt khối bã để thu đƣợc nhiều dịch hơn. Bã bắp có thể dùng làm thức ăn cho gia súc.
2.1.2.Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hƣởng của lƣợng giống, thời gian lên men sau
khi cố định hàm ẩm đến pH, mật độ tế bào, hàm lƣợng tinh bột còn lại trong cơ chất và hàm lƣợng cồn sinh ra.
a/Mục đích:
Xác định mật độ tế bào nấm men, hàm lƣợng tinh bột còn lại trong cơ chất và hàm lƣợng cồn sinh ra.
b/Cách tiến hành thí nghiệm:
Hàm ẩm của bắp trƣớc khi gieo men là 77,4%.
Lƣợng giống sử dụng là 17%, 20%, 23%, 26% đƣợc lên men ở nhiệt độ 28oC.
Xác định pH: Phƣơng pháp xác định pH:
Sử dụng máy đo pH Tritino của phịng thí nghiệm. Tiến hành đo pH của dung dịch với 3 lần đo và lấy kết quả trung bình cộng của 3 kết quả để lấy pH chính xác nhất.
Hình : Máy đo pH Tiến hành:
Thí nghiệm đƣợc khảo sát trên bắp đã hấp (mẫu rắn) nên rất khó theo dõi pH theo từng giờ lên men. Do đó, ở đây chỉ tiến hành khảo sát sự thay đổi pH trong các mốc thời gian là: 0 giờ, 72 giờ (thời điểm sinh khối tăng nhiều), 120 giờ (thời điểm cồn sinh ra nhiều nhất), 168 giờ (thời điểm kết thúc quá trình lên men chính). Để có thể xác định pH vào thời điểm lúc bắt đầu lên men,
tiến hành nghiền mịn 10 gam bắp sau đó hút 10 ml nƣớc cất cho vào cốc 100ml và trộn đều. Đo và ghi nhận giá trị pH của dịch cháo này ( sử dụng máy đo pH với mức độ tin cậy là 0,001 ).
Xác định mật độ tế bào nấm men bằng phƣơng pháp đếm tế bào [9] Có nhiều phƣơng pháp định lƣợng sự hiện diện của vi sinh vật, ví dụ nhƣ: đếm số lƣợng tế bào trực tiếp trên kính hiển vi, định lƣợng giá tiếp thông qua mức độ cản ánh sáng (độ đục), đếm số khuẩn lạc mọc trên một môi trƣờng xác định, định lƣợng một cách thống kê phƣơng pháp pha loãng tới hạn (phƣơng pháp MPN)…
Phƣơng pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. Cấu tạo buồng đếm hồng cầu:
Buồng đếm hồng cầu thƣờng là một phiến kính dày 2 – 3mm có một vùng đĩa đếm nằm giữa phiến kính và đƣợc bao bọc bởi một rãnh, Đãi đếm thấp hơn bề mặt của phiến kính khoảng 1/10mm, có hình trịn vì thế khi đƣợc phủ lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau. Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2 và đƣợc chia thanh 25 ơ vng lớn có diện tích mỗi ơ là 1/25 mm2 và 400 ơ vng nhỏ hơn, mỗi ơ có diện tích 1/400mm2
. Cách tiến hành:
Pha loãng huyền phù tế bào vi sinh vật thành năm độ pha loãng liên tiếp là 101, 102, 103, 104, 105.
Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào (đã pha loãng), dùng pippet để hút dịch huyền phù này.
Đậy buồng đếm bằng một phiến kính mỏng.
Nhẹ nhàng dung đầu pipipet (có một giọt huyền phù vi sinh vật), đặt vào cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính mỏng). Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn.
Di chuyển khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang.
Đặt buồng kính lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x10 để tìm buồng đếm.Sau đó, chuyển sang vật kính x40 để quan sát.
Điều chỉnh cƣờng độ ánh sáng bằng cửa sập để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn các đƣờng kẻ. Chọn một ơ trung tâm và bốn ơ nằm ngồi bìa để đếm.
Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3 – 5 phút, và đếm luôn tế bào nằm trên hai đƣờng kẻ kề nhau đƣợc chọn của từng ô.
Xác định hàm lƣợng cồn sinh ra bằng phƣơng pháp chƣng cất:
Cơ sở khoa học của quá trình chƣng cất cồn là: phân tách hỗn hợp chất lỏng có nhiệt độ sơi khác nhau (dẫn đến chúng có nhiệt độ bay hơi khác nhau). Ở điều kiện áp suất thƣờng, nhiệt độ sôi của rƣợu là 78,30C và nƣớc là 1000C. Khi tiến hành chƣng cất, rƣợu sẽ bốc hơi sớm và nhanh hơn nƣớc do vậy mà tách đƣợc rƣợu ra khỏi nƣớc.
Tiến hành:
Lấy 50ml dịch bắp sau lên men và 1 tấm giấy lọc cho vào bình tam giác có dung tích 500ml. Chúng tơi sử dụng giấy lọc để bọt không trào lên, ảnh hƣởng đến quá trình bay hơi của cồn. Tiến hành chƣng cất với tốc độ đều cho đến hết cồn trong mẫu, thời gian khoảng 60 – 90 phút. Để cồn bay hơi ra nhanh không bị mất, ống sinh hàn phải đƣợc làm lạnh bằng nƣớc đá và bình t h u cồn phải đ ậ y kín tránh cồn bay hơi. Để nguội đến nhiệt độ 250C, đem cồn vừa thu đƣợc cân xác định khối lƣợng riêng giữa cồn với nƣớc (d250C/250C).Tra bảng 01: Density of ethanol at various temperatures( kg/l hoặc g/cm3) ở Phụ lục ta đƣợc phần trăm thể tích của cồn.
Xác định hàm lƣợng tinh bột còn lại trong cơ chất bằng phƣơng pháp thủy phân tinh bột bằng HCl [2]:
Nguyên tắc: sau khi loại bỏ các tạp chất có trong mẫu vật, tinh bột đƣợc hòa tan trong HCl. Sau đó, tủa tinh bột bằng cồn 900C. Rửa tủa và sấy khơ, đem cân để tính hàm lƣợng tinh bột trong mẫu vật.
Tiến hành:
Cân chính xác 2g bắp đã giã nát. Rửa hai lần với ete dầu hỏa, mỗi lần cho vào 25ml ete dầu hỏa, lắc 5 phút, ly tâm đổ bỏ dung mơi ở phía trên(dung mơi có thể bị vẫn đục). Đun ấm để dung mơi cịn lại trong ống bay hơi hết.
Tiếp tục rửa bã trong ống hai lần vớ NaCl 10%, mỗi lần cho vào 50ml dung dịch NaCl 10%, lắc trong 15 phút, ly tâm đổ bỏ dung môi bên trên (dung mơi có thể bị vẩn đục).
Rửa cùng cách nhƣ trên them hai lần nữa – một lần với cồn 700 và một lần vớ nƣớc, mỗi lần lắc 1 – 2 phút. Làm ấm vài phút để bay hơi hết nƣớc, để nguội.
Lấy hết bã tinh bột cho vào cốc thủy tinh, thêm 11ml nƣớc cất và 14 ml HCl đậm đặc. Khuấy kỹ để tinh bột hòa tan trong dung dịch acid. Cho dung dịch tinh bột vào bình định mức 100ml, tráng rửa cốc thủy tinh và đổ vào bình. Làm đầy đến vạch mức. Lọc nếu có cặn.
Lấy 50ml dung dịch tinh bột cho vào cốc thủy tinh 250ml, thêm vào 110ml cồn 960. Khuấy đều để yên khoảng 1 giờ để tinh bột kết tủa hết. Đem ly tâm.Rửa tinh bột hai lần, một lần với 25ml cồn 700 và một lần với 25ml cồn 960. Cho tủa tinh bột vào một đĩa peptri đã rửa sạch, sấy khô và cân trọng lƣợng trƣớc. Sấy ở 1300C trong một giờ. Để nguội trong bình hút ẩm và cân. Cơng thức tính hàm lƣợng tinh bột cịn lại trong cơ chất:
c/Sơ đồ bố trí thí nghiệm Nƣớc thải Lõi bắp Nƣớc Bắp Hấp To= 100oO,t = 1 giờ Làm nguội ToC=28oC Rửa sạch Bào mỏng Lọc Gieo men Lên men Men(17%, 20%,23%,26%) Bã bắp Rƣợu bắp Hãm cồn Rƣợu gạo
d/Chỉ tiêu theo dõi
Ở từng tỉ lệ phối giống và thời gian lên men, tiến hành theo dõi pH, mật độ tế bào đếm đƣợc, hàm lƣợng cồn sinh ra và hàm lƣợng tinh bột còn lại trong cơ chất.