khả năng hình thành rễ của chồi Lan Hồ Điệp
Sau khi nhân chồi được số lượng đủ lớn, giai đoạn kế tiếp là tạo cây hoàn chỉnh chuẩn bị đưa ra ngoài vườn ươm. Cây ra vườn ươm không chỉ đủ
tiêu chuẩn về tạo lá, mà các tiêu chuẩn về rễ như: Số lượng rễ, chiều dài rễ, độ
mập của rễ…đều là các yếu tố quyết định. Khi nuôi cấy trong điều kiện bình thường hoặc trên môi trường có bổ sung nồng độ BAP thấp cây Lan Hồ Điệp vẫn ra rễ và thường chỉ có 1 hoặc 2 rễ. Nhưng khi đưa ra vườn ươm ngoài tự
nhiên thường bị chết do bộ rễ mảnh, yếu, khó thích nghi với môi trường mới. Môi trường tạo rễ thường là các môi trường có bổ sung các hợp chất của auxin. Để tìm hiểu vấn đề này chúng tôi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi lan HồĐiệp. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 11.
Bảng 11. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Công thức Nồng độ NAA (g/l) Số lượng mẫu Số chồi phát sinh rễ Số rễ thu được Tỷ lệ tạo rễ (%) Số chồi phát sinh rễ Số rễ thu được Tỷ lệ tạo rễ (%) D1 0 50 19 24 1,26 26 32 1,23 D2 0,5 50 44 57 1,29 56 61 1,08 D3 1,0 50 46 92 2 50 111 2,22 D4 1,5 50 48 109 2,27 50 121 2,42 D5 2,0 50 45 98 2,18 47 103 2,19 D6 2,5 50 42 91 2,16 45 97 2,16
Qua bảng số liệu thu được cho thấy: Trên môi trường khổng bổ sung NAA tỷ lệ chồi ra rễ đạt thấp hơn so với các môi trường có bổ sung NAA chỉ
có 19% sau 2 tuần và 26% sau 4 tuần nuôi cấy.
Ở môi trường có bổ sung NAA tỷ lệ chồi ra rễ tăng dần khi nồng độ
NAA tăng từ (0,5-1,5) mg/l. Tiếp tục tăng nồng độ NAA lên thì tỷ lệ chồi ra rễ không tăng mà còn giảm đi. Tỷ lệ chồi tạo rễ cao nhất đạt 2,27 sau 2 tuần nuôi cấy và 2,42 sau 4 tuần nuôi cấy ở CT D4 với nồng độ NAA là 1,5 mg/l.
Như vậy môi trường thích hợp cho việc tạo rễ trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh đểđưa ra vườn ươm là: Vacin + 1,5 g/l NAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
A B
Hình 4.11. Sự tạo rễở CT D4
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Từ các kết quả trên chúng tôi đã thu được quy trình nuôi cấy in vitro giống Lan nghiên cứu Phalaenopsis amabilis với các giai đoạn cụ thể như sau: - Nồng độ và thời gian khử trùng tốt nhất cho ngồng Lan Hồ Điệp là HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút, cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất đạt 70%.
- Nồng độ BAP bằng 1,0 mg/l cho khả năng tạo chồi từ mắt ngủ cao nhất đạt 42,7% sau 2 tuần nuôi cấy và 69,86% sau 4 tuần nuôi cấy.
- Môi trường thích hợp cho việc phát sinh mô sẹo của nụ hoa là: MS + 0,5 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6g/l Agar
- Bổ sung 1000 mg/l Casein Hydrolysate hoặc 1000 mg/l Malt extract vào môi trường là phù hợp cho sự tăng trưởng của mô sẹo và phôi vô tính với khối lượng mô sẹo tăng nhanh đạt 1,69 lần và 1,64 lần.
- Khả năng để tạo chồi tốt nhất là ở nồng độ 1,0 mg/l NAA kết hợp với 1 mg/l BAP cho hệ số nhân sau 2 tuần là 4,12 lần và sau 4 tuần là 4,88 lần với môi trường ưu việt là: MS + 1,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar
- Nồng độ BAP bổ sung vào môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi của Lan HồĐiệp là 1,5 mg/l. Môi trường thích hợp để nhân nhanh là: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
- Môi trường bổ sung dịch chiết hữu cơ: nước dừa và chuối xanh thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi là: Vacin + 30g/l đường + 1,5mg/l BAP + 6g Agar + 150ml nước dừa + 20g/l chuối xanh
- Môi trường thích hợp kéo dài chồi là: Vacin + 30g/l đường + 1,5mg/l BAP + 6g Agar + 150ml nước dừa + 20g/l chuối xanh + 0,3mg/l GA3 + 0,5mg/l BAP - Để ngăn ngừa hiện tượng hoá đen của Lan Hồ Điệp thì bổ sung 3g/l PVP cho hiệu quả tốt nhất, môi trường hầu như không bị hoá đen.
- Môi trường thích hợp cho việc ra rễ tạo cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn
5.2. Đề nghị
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên chúng tôi chưa tiến hành được các thí nghiệm đưa cây ra vườn ươm trong nội dung khóa luận này .
Trong thời gian tới đây, chúng tôi sẽ tiếp tục hoàn thiện qui trình nhân nhanh giống Lan mới có chất lượng hoa tốt.
TÀI LIỆU THAM THẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2005), “Kỹ thuật chọn tạo, nhân giống và nuôi trồng Lan HồĐiệp”, NXB Nông Nghiệp.
2. Nguyễn Quang Thạch (2000), “Trồng hoa xuất khẩu ở miền Bắc cơ hội và thách thức”
3. Đỗ Năng Vịnh, 2005, “Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng”, NXB Nông (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nghiệp.
4. Đỗ Năng Vịnh, 2002, “CNSH cây trồng”, NXB Nông Nghiệp.
5. Dương Tấn Nhựt (chủ biên) 2007, “Hội nghị khoa học-CNSH thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa”, NXB Nông Nghiệp.
6. Dương Công Kiên, “Nuôi cấy mô tậpI, tập III”, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
7. Bùi Trang Việt, “Sinh lý thực vật đại cương, phần II: Phát triển”, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh.
8. Dương Tấn Nhựt, “Công nghệ sinh học thực vật, tập I”, Nhà xuất bản nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh.
9. Trần Văn Minh, “Công nghệ tế bào thực vật”, Nhà xuất bản trường Đại học Nông Lâm, Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
10. Cung Hoàng Phi Phượng, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Quốc Thiện, Dương Hoa Xô, Nguyễn Quốc Bình, 2007, “Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây lan Hồđiệp lai (Phalaenopsis hybrid)”
11. Trần Duy Quý, 2005, “Sổ tay người Hà Nội chơi lan”, Hội Lan Hà Nội, NXB Nông Nghiệp
12. Phạm Hoàng Hộ, 2000, “Cây cỏ Việt Nam”, NXB Trẻ
Tài liệu nước ngoài
1. Tarres E., Magioli C., Margis-Pinheiro M., Sachetto-Martins G. , Mansur Lygia E. M., Santiago-Fernandes, “In-vitro somatic embryogeneis and
adventitious rootinitiation have a common origin in eggplant (Solanum melongena L)”. Revista Brasil Botany, Vol 27, PP 70-84.
2. Tisserat B. and Murashige T., 1977, “Effect ethephon, ethylen and 2,4-D on asexual embryogenesis in vitro”, Plant physiology, Vol 60. PP 437-439. 3. West M.A.L. and Harada J.J, 1993, “Embryogenesis in higher plant: An overview”, Plant cell, Vol5, PP 1361 – 1369.
4. Arrditti, 1979; Garay, 1960 5. Goh, 1973; Goh, Lonhard 6. Kim et al, 1970; Singh, 1976
7. Ken Tokuhara and Masahiro mii, 1993 8. Intwong et at, 1972, Reiginger et at, 1976 9. Zimmer and Pieper 1978, Ichihashi 1992 10. Homma and Asahira 1895, Lin 1986
11. Champagnat and Morel, 1969; Churchill et at, 1971,1973 12. Letham 1974, Van Standen and Drewes, 1975
13. Saprorhx-teahultum, 1953; Camphell, 1964 14. Irawati, Harjadi, Suseno and Idris, 1977 15. Fu, 1979, Holttumara Teo and Wong, 1978
16. Champagnat and Morel, 1969; Churchill et at, 1971,1973 17. Letham 1974, Van Standen and Drewes, 1975
Tài liệu Internet
1. http://d.violet.vn/uploads/resources/49/40388/preview.swf 2. http://www.vietnamplus.vn/Home/Nhan-giong-Lan-Ho-Diep-lai-bang- phuong-phap-moi/200910/22111.vnplus 3. http://www.hoalanvietnam.org/Article.asp?ID=18 4. http://www.nongsinh.com/Nhan_giong_vo_tinh_phong_lan_HoiNghi_ Dalat.pdf 5. http://www.hcmbiotech.com.vn/news_detail.php?cateid=10&id=835
6. http://www.hcmbiotech.com.vn/picture_center_detail.php?cateid=21&c urrent_page=3 7. http://www.hcmbiotech.com.vn/picture_center_detail.php?cateid=21&c urrent_page=3 8. http://www.tuvannongnghiep.com.vn/tintuc/default.aspx?cat_id=772& news_id=1847 9. http://dost.danang.gov.vn/default.php?Action=news_detail&idx=153 10.http://dost.danang.gov.vn/default.php?Action=news_detail&idx=153 11.http://www.longdinh.com/default.asp?act=chitiet&ID=4705&catID=6 12.http://maxreading.com/?chapter=31025 13.http://tintuc.xalo.vn/0016039246/thu_choi_lan_cua_nguoi_ha_noi.html 14.http://caucaquangbinh.com/home/index.php?option=com_content&vie w=article&id=858:lan-rng&catid=87:sinh-vt-cnh&Itemid=385
Lời Cảm Ơn
Để hoàn thành khoá luận này trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Ts. Hà Thị Thuý – phó trưởng phòng, phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp.
Tôi xin cảm ơn KS. Dương Minh Nga người đã gợi mở cho tôi những phương hướng nghiên cứu và đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập.
Tôi xin cảm ơn toàn thể các anh chị trong phòng thí nghiệm trọng điểm Viện Di Truyền Nông Nghiệp Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi trong quá trình thực tập.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tập thể cán bộ giáo viên Khoa CNSH Viện Đại Học Mở Hà Nội đã hướng dẫn giảng dạy và chỉ bảo tôi tận tình trong quá trình học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè những người luôn bên tôi
đã động viên khuyến khích tôi trong thời gian học tập để hoàn thành khoá luận này.
Hà Nội, ngày 02 tháng 04 năm 2010 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sinh viên thực hiện
CHỮ VIẾT TẮT VÀ MỘT SỐ THUẬT NGỮ
NCM : Nuôi cấy mô
2,4D : 2,4 dichorophenoxi acetic acid BAP : Benzyl Amino Purin
NAA : Naphtyl Acetid Axid GA3 : Acid Gibberellin
MS : Mura Shige & Skoog, 1962 CT : Công thức
TN : Thí nghiệm CTTD : Chỉ tiêu theo dõi
PLB : Protocorm like body là những thể có dạng tương tự Protocorm nhưng phát triển từ những phần mô khác nhau của Lan (ví dụ như lát cắt mô lá), không phải từ hạt.
Protocorm: Trong quá trình nảy mầm, hạt Lan chứa phôi tạo ra cấu trúc có dạng củ hoặc tiền chồi được gọi là Protocorm, mà từđó sẽ phát triển thành một cây hoàn thiện. Trong môi trường nuôi cấy in vitro, phần sinh dưỡng của nhiều loài Lan tạo ra Protocorm mềm, tròn, mà từ đó chúng có thể được nhân lên hoặc bật chồi thành một cây con. (Glossary ò biotechnology and genetic
engineering-FAO CORPORATE DOCUMENT REPOSITORY).
MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
Knudson C KC(1946)
Murashige and Shoog MS(1962)
Vacin and Went VW(1949)
CaCl2* 6 H2O 440 mg Ca(NO3)2 * 4 H2O 1000 mg Ca3(PO4)2 200 mg CoCl2 * 6 H2O 0,025 mg CuSO4 * 5 H2O 0,025 mg FeSO4 * 7 H2O 25 mg 27,8 mg Ferric tartrate 28 mg H3BO3 6,2 mg KH2PO4 250 mg 170 mg 250 mg KI 0,83 mg KNO3 1900 mg 525 mg MgSO4 * 7 H2O 250 mg 370 mg 250 mg MnSO4 * 4 H2O 7,5 mg 22,3 mg 7,5 mg Na2MoO4 * 6 H2O 0,25 mg NH4NO3 1650 mg (NH4)2SO4 500 mg 500 mg ZnSO4 * 7 H2O 8,6 mg Glycine 2,0 mg Indoleacetic acid 1-30 mg Kinetine 0,04-10 mg Myo-inositol 0,5 mg Pyridoxine HCl 0,5 mg Thiamine HCl 0,1 mg MỤC LỤC PHẦN 1. MỞĐẦU...1 PHẦN 2. TỔNG QUAN...3
2.1. Giá trị kinh tế của hoa Lan...3
2.1.1. Trên thế giới...3
2.1.2. Ở Việt Nam...4
2.1.3. Tầm quan trọng đối với việc duy trì và bảo vệ nguồn giống...5
2.2.1. Giới thiệu chung về họ Lan...6
2.2.2. Giới thiệu về giống Lan HồĐiệp Phalanopsis...6
2.3. Các phương pháp nhân giống hoa Lan...10
2.3.1. Phương pháp nhân giống hữu tính...10
2.3.2. Phương pháp nhân giống vô tính...10
2.3.2. Phương pháp vi nhân giống (micropropagation)...12
2.3.3. Nhân giống Lan bằng phương pháp NCM tế bào...13
PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...22
3.1. Vật liệu...22
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu...22
3.2.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy...23 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng đối với ngồng hoa Lan HồĐiệp...23
3.2.2. Giai đoạn tạo thể nhân nhanh in vitro...23
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP từ (0- 2,5) mg/l đến khả năng tạo chồi từ mắt ngủ của Lan HồĐiệp...23
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của 2,4D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,1mg/l IAA lên quá trình phát sinh mô sẹo ở nụ hoa (tính theo tỷ lệ %)...24
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của chất bổ sung vào môi trường đến biểu hiện phân hoá mô sẹo của Lan HồĐiệp...24
3.2.3. Giai đoạn nhân nhanh in vitro...24
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và nồng độ BAP = 1,0 mg/l đến khả năng tạo chồi của Lan HồĐiệp...24
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân nhanh chồi của Lan Hồ Điệp...25
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của nước Dừa đến quá trình nhân nhanh chồi của Lan HồĐiệp...25
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của chuối xanh đến quá trình nhân nhanh chồi của Lan HồĐiệp...25
Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi tạo chồi của Lan HồĐiệp...26
Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của các chất chống oxy hoá đến khả năng ngăn ngừa hiện tượng hoá đen môi trường của Lan HồĐiệp...26
3.2.4. Giai đoạn tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh...26
Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi Lan HồĐiệp...26
3.3. Điều kiện nuôi cấy...27
3.4. Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi trong nuôi cấy mô tế bào...27
3.5. Phương pháp xử lý số liệu:...28
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...29
4.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng; nồng độ và thời gian khử trùng đối với ngồng Lan HồĐiệp...29
4.2. Giai đoạn tạo thể nhân nhanh in vitro...30
4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo chồi từ mắt ngủ của giống Lan HồĐiệp...30
4.2.2. Ảnh hưởng của 2,4D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,1mg/l IAA lên quá trình phát sinh mô sẹo ở nụ hoa (tính theo tỷ lệ %)...32
4.2.3. Ảnh hưởng của chất bổ sung vào môi trường đến biểu hiện phân hoá mô sẹo của Lan HồĐiệp...33
4.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và nồng độ BAP = 1,0 mg/l đến khả năng tạo
chồi của Lan HồĐiệp...35
4.3.2. Ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân nhanh chồi của Lan HồĐiệp....37
4.3.3. Ảnh hưởng của nước Dừa đến quá trình nhân nhanh chồi của Lan HồĐiệp ...39
4.3.4. Ảnh hưởng của chuối xanh đến quá trình nhân nhanh chồi của Lan Hồ Điệp...40
4.3.5. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi tạo chồi của Lan HồĐiệp ...41
4.3.6. Ảnh hưởng của các chất chống oxy hoá đến khả năng ngăn ngừa hiện tượng hoá đen môi trường của Lan HồĐiệp...43 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.4. Giai đoạn tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh - Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi Lan HồĐiệp...44
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...46
5.1. Kết luận...46
5.2. Đề nghị...47
4. Quy trình biến nạp bằng sốc nhiệt ... 31
5. Giải trình tự và phân tích trình tự gen apr... 32
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...33
3.1. Đặc điểm sinh học của chủng Bacillus subtilis HT24...33
3.1.1. Đặc điểm nuôi cấy của chủng B. subtilis HT24... 33
3.1.2. Nghiên cứu đặc điểm tế bào của chủng B. subtilis HT24 ... 34
3.1.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa của chủng B. subtilis HT24... 34
3.2. Nghiên cứu khả năng lên men sinh tổng hợp proteaza của chủng Bacillus subtilis HT24 ...36
3.2.1 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp ... 36
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon/nitơ ... 37
3.3. Nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp proteaza của chủng Bacillus subtilis HT24 ...39
3.3.1. Ảnh hưởng của pH ban đầu ... 39
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ... 40
3.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống... 41
3.3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dịch nuôi trên thể tích bình ... 41
3.4. Động thái lên men sinh tổng hợp proteaza của chủng B. subtilis HT24 trong bình tam giác ... 42
3.5. Tách dòng gen mã hóa proteaza (apr)...44
3.5.1. Tách ADN tổng số của chủng B. subtilis HT24 ... 44
3.5.2. Khuếch đại gen apr của chủng B. subtilis HT24 ... 44
3.5.3. Tách dòng gen apr... 45