Hồ Điệp
Sau khi tiến hành thí nghiệm ở bảng 7, chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của chuối xanh đến quá trình nhân nhanh chồi Lan Hồ Điệp, với môi trường nền là: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước dừa + 0 g/l chuối xanh + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 8.
Bảng 8. Ảnh hưởng của chuối xanh đến quá trình nhân nhanh chồi của
Lan Hồ Điệp
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Công thức Nồng độ (g/l) Số lượng mẫu Số chồi thu được Hệ số nhân Số chồi thu được Hệ số nhân C1 0 50 71 1,42 79 1,58 C2 10 50 76 1,52 83 1,66 C3 20 50 98 1,96 124 2,48 C4 30 50 78 1,56 87 1,74 C5 40 50 72 1,44 82 1,64
0 0.5 1 1.5 2 2.5 C1 C2 C3 C4 C5 Hệ số nhân sau 2 tuần nuôi cấy Hệ số nhân sau 4 tuần nuôi cấy
Hình 4.9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của chuối xanh tới hệ số nhân nhanh của chồi
Kết quả bảng 8 cho thấy với việc bổ sung 20 g/l chuối xanh cho hệ số
nhân cao nhất đạt 1,96 lần sau 2 tuần và 2,48 lần sau 4 tuần nuôi cấy. Từ kết quả bảng 7 và 8 cho thấy: Việc bổ sung nước dừa, chuối xanh vào môi trường nhân nhanh đều cho tác dụng rất tích cực trong việc tăng hệ số nhân, không những thế chất lượng chồi thu được lại rất tốt và đồng đều. Môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi Lan Hồ Điệp là: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước dừa + 20 g/l chuối xanh + 30 g/l đường + 6 g/l Agar 4.3.5. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi tạo chồi của Lan
Hồ Điệp
Để nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 và BAP lên quá trình kéo dài chồi của lan Hồ Điệp chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp GA3 ở các nồng độ từ (0-0,5) mg/l. Kết quả theo dõi được thể hiện ở bảng 9.
Bảng 9. Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi tạo chồi của Lan Hồ Điệp
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Công thức Nồng độ GA3 (mg/l) Số lượng mẫu Số chồi thu được Tỷ lệ tạo chồi Chiều cao của chồi Số chồi thu được Tỷ lệ tạo chồi Chiều cao của chồi G1 0 100 31 0,31 3,3±0,05 42 0,42 5,1±0,07 G2 0,1 100 39 0,39 3,8±0,08 47 0,47 6,4±0.12 G3 0,2 100 56 0,56 4,4±0,09 65 0,65 7,2±0,04 G4 0,3 100 74 0,74 5,2±0,04 126 1,26 7,9±0,03 G5 0,4 100 70 0,70 4,9±0,11 76 0,76 6,9±0,07 G6 0,5 100 72 0,72 4,5±0,07 79 0,79 6,8±0,09 Kết quả bảng 9 cho thấy: Khi bổ sung GA3 vào môi trường đều cho tỷ
lệ tạo chồi và chiều cao chồi tốt hơn với môi trường không có GA3.
Ở CT G4 cho tỷ lệ tạo chồi và chiều cao chồi là ưu việt nhất: Sau 2 tuần nuôi cấy tỷ lệ tạo chồi thu được đạt 0,74%, chiều cao của chồi là 5,2±0,04 và sau 4 tuần nuôi cấy tỷ lệ tạo chồi đạt 1,26%, chiều cao chồi là 7,9±0,03. Trên số chồi thu được có những lá mở rộng, có màu xanh đều.
Ở các CT còn lại cho tỷ lệ tạo chồi và chiều cao chồi thấp hơn và chất lượng chồi không đẹp so với CT G4. Chất lượng chồi thu được không đồng
đều.
Như vậy nồng độ 0,3 mg/l GA3 + 0,5 mg/l BAP là thích hợp nhất cho việc kéo dài chồi của Lan HồĐiệp.
4.3.6. Ảnh hưởng của các chất chống oxy hoá đến khả năng ngăn ngừa
hiện tượng hoá đen môi trường của Lan Hồ Điệp
Đối với Lan Hồ Điệp qua cấy chuyển, mẫu nuôi cấy có hiện tượng tiết chất có bản chất phenol khi bị oxy hoá sẽ gây hoá đen môi trường và khả
năng sinh trưởng phát triển của mẫu giảm. Để ngăn cản hiện tượng này, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm bổ sung một số chất chống oxy hoá vào môi trường. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 10.
Bảng10. Ảnh hưởng của các chất chống oxy hoá đến khả năng ngăn ngừa hiện tượng hoá đen môi trường
CT\ CTTD Mức độ hoá đen Chiều cao (cm) Số lá/cây (lá) Số rễ/cây (rễ) O1 +++ 3,56 4,03 4,34 O2 ++ 3,84 4,56 5,12 O3 ++ 3,86 4,11 4,87 O4 ++ 3,79 4.39 4,42 O5 + 4,31 3,48 5,98 O6 - 4,27 4,49 5,12 O7 - 5.03 4,41 5,59 VTMC : Vitamin C PVP : Polyvinyl pirolliden
- : Môi trường hầu như không bị hoá đen + : Môi trường có màu nâu
++ : Môi trường có màu nâu đen +++ : Môi trường rất đen
Kết quả cho thấy việc bổ sung các chất như VTM C, PVP đều có tác dụng hạn chế sự tiết chất đen của mẫu vào môi trường nuôi cấy và làm tăng sinh trưởng của chồi so với mẫu đối chứng. Trong đó PVP với liều lượng bổ
sung là 3g/l tỏ ra hiệu quả nhất. Chúng tôi đã làm thí nghiệm tăng nồng độ
PVP lên nhưng cho kết quả không tốt hơn mà còn làm tốn kém hoá chất. Như
vậy, môi trường thích hợp để ngăn ngừa hiện hoá đen môi trường của Lan Hồ Điệp là: MS + 3 g/l PVP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.10. Chồi Lan ở CT O7, O5 và O1
4.4. Giai đoạn tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh - Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi Lan Hồ Điệp khả năng hình thành rễ của chồi Lan Hồ Điệp
Sau khi nhân chồi được số lượng đủ lớn, giai đoạn kế tiếp là tạo cây hoàn chỉnh chuẩn bị đưa ra ngoài vườn ươm. Cây ra vườn ươm không chỉ đủ
tiêu chuẩn về tạo lá, mà các tiêu chuẩn về rễ như: Số lượng rễ, chiều dài rễ, độ
mập của rễ…đều là các yếu tố quyết định. Khi nuôi cấy trong điều kiện bình thường hoặc trên môi trường có bổ sung nồng độ BAP thấp cây Lan Hồ Điệp vẫn ra rễ và thường chỉ có 1 hoặc 2 rễ. Nhưng khi đưa ra vườn ươm ngoài tự
nhiên thường bị chết do bộ rễ mảnh, yếu, khó thích nghi với môi trường mới. Môi trường tạo rễ thường là các môi trường có bổ sung các hợp chất của auxin. Để tìm hiểu vấn đề này chúng tôi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi lan HồĐiệp. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 11.
Bảng 11. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Công thức Nồng độ NAA (g/l) Số lượng mẫu Số chồi phát sinh rễ Số rễ thu được Tỷ lệ tạo rễ (%) Số chồi phát sinh rễ Số rễ thu được Tỷ lệ tạo rễ (%) D1 0 50 19 24 1,26 26 32 1,23 D2 0,5 50 44 57 1,29 56 61 1,08 D3 1,0 50 46 92 2 50 111 2,22 D4 1,5 50 48 109 2,27 50 121 2,42 D5 2,0 50 45 98 2,18 47 103 2,19 D6 2,5 50 42 91 2,16 45 97 2,16
Qua bảng số liệu thu được cho thấy: Trên môi trường khổng bổ sung NAA tỷ lệ chồi ra rễ đạt thấp hơn so với các môi trường có bổ sung NAA chỉ
có 19% sau 2 tuần và 26% sau 4 tuần nuôi cấy.
Ở môi trường có bổ sung NAA tỷ lệ chồi ra rễ tăng dần khi nồng độ
NAA tăng từ (0,5-1,5) mg/l. Tiếp tục tăng nồng độ NAA lên thì tỷ lệ chồi ra rễ không tăng mà còn giảm đi. Tỷ lệ chồi tạo rễ cao nhất đạt 2,27 sau 2 tuần nuôi cấy và 2,42 sau 4 tuần nuôi cấy ở CT D4 với nồng độ NAA là 1,5 mg/l.
Như vậy môi trường thích hợp cho việc tạo rễ trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh đểđưa ra vườn ươm là: Vacin + 1,5 g/l NAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
A B
Hình 4.11. Sự tạo rễở CT D4
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Từ các kết quả trên chúng tôi đã thu được quy trình nuôi cấy in vitro giống Lan nghiên cứu Phalaenopsis amabilis với các giai đoạn cụ thể như sau: - Nồng độ và thời gian khử trùng tốt nhất cho ngồng Lan Hồ Điệp là HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút, cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất đạt 70%.
- Nồng độ BAP bằng 1,0 mg/l cho khả năng tạo chồi từ mắt ngủ cao nhất đạt 42,7% sau 2 tuần nuôi cấy và 69,86% sau 4 tuần nuôi cấy.
- Môi trường thích hợp cho việc phát sinh mô sẹo của nụ hoa là: MS + 0,5 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6g/l Agar
- Bổ sung 1000 mg/l Casein Hydrolysate hoặc 1000 mg/l Malt extract vào môi trường là phù hợp cho sự tăng trưởng của mô sẹo và phôi vô tính với khối lượng mô sẹo tăng nhanh đạt 1,69 lần và 1,64 lần.
- Khả năng để tạo chồi tốt nhất là ở nồng độ 1,0 mg/l NAA kết hợp với 1 mg/l BAP cho hệ số nhân sau 2 tuần là 4,12 lần và sau 4 tuần là 4,88 lần với môi trường ưu việt là: MS + 1,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar
- Nồng độ BAP bổ sung vào môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi của Lan HồĐiệp là 1,5 mg/l. Môi trường thích hợp để nhân nhanh là: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
- Môi trường bổ sung dịch chiết hữu cơ: nước dừa và chuối xanh thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi là: Vacin + 30g/l đường + 1,5mg/l BAP + 6g Agar + 150ml nước dừa + 20g/l chuối xanh
- Môi trường thích hợp kéo dài chồi là: Vacin + 30g/l đường + 1,5mg/l BAP + 6g Agar + 150ml nước dừa + 20g/l chuối xanh + 0,3mg/l GA3 + 0,5mg/l BAP - Để ngăn ngừa hiện tượng hoá đen của Lan Hồ Điệp thì bổ sung 3g/l PVP cho hiệu quả tốt nhất, môi trường hầu như không bị hoá đen.
- Môi trường thích hợp cho việc ra rễ tạo cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn
5.2. Đề nghị
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên chúng tôi chưa tiến hành được các thí nghiệm đưa cây ra vườn ươm trong nội dung khóa luận này .
Trong thời gian tới đây, chúng tôi sẽ tiếp tục hoàn thiện qui trình nhân nhanh giống Lan mới có chất lượng hoa tốt.
TÀI LIỆU THAM THẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2005), “Kỹ thuật chọn tạo, nhân giống và nuôi trồng Lan HồĐiệp”, NXB Nông Nghiệp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Nguyễn Quang Thạch (2000), “Trồng hoa xuất khẩu ở miền Bắc cơ hội và thách thức”
3. Đỗ Năng Vịnh, 2005, “Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng”, NXB Nông
Nghiệp.
4. Đỗ Năng Vịnh, 2002, “CNSH cây trồng”, NXB Nông Nghiệp.
5. Dương Tấn Nhựt (chủ biên) 2007, “Hội nghị khoa học-CNSH thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa”, NXB Nông Nghiệp.
6. Dương Công Kiên, “Nuôi cấy mô tậpI, tập III”, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
7. Bùi Trang Việt, “Sinh lý thực vật đại cương, phần II: Phát triển”, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh.
8. Dương Tấn Nhựt, “Công nghệ sinh học thực vật, tập I”, Nhà xuất bản nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh.
9. Trần Văn Minh, “Công nghệ tế bào thực vật”, Nhà xuất bản trường Đại học Nông Lâm, Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
10. Cung Hoàng Phi Phượng, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Quốc Thiện, Dương Hoa Xô, Nguyễn Quốc Bình, 2007, “Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây lan Hồđiệp lai (Phalaenopsis hybrid)”
11. Trần Duy Quý, 2005, “Sổ tay người Hà Nội chơi lan”, Hội Lan Hà Nội, NXB Nông Nghiệp
12. Phạm Hoàng Hộ, 2000, “Cây cỏ Việt Nam”, NXB Trẻ
Tài liệu nước ngoài
1. Tarres E., Magioli C., Margis-Pinheiro M., Sachetto-Martins G. , Mansur Lygia E. M., Santiago-Fernandes, “In-vitro somatic embryogeneis and
adventitious rootinitiation have a common origin in eggplant (Solanum melongena L)”. Revista Brasil Botany, Vol 27, PP 70-84.
2. Tisserat B. and Murashige T., 1977, “Effect ethephon, ethylen and 2,4-D on asexual embryogenesis in vitro”, Plant physiology, Vol 60. PP 437-439. 3. West M.A.L. and Harada J.J, 1993, “Embryogenesis in higher plant: An overview”, Plant cell, Vol5, PP 1361 – 1369.
4. Arrditti, 1979; Garay, 1960 5. Goh, 1973; Goh, Lonhard 6. Kim et al, 1970; Singh, 1976
7. Ken Tokuhara and Masahiro mii, 1993 8. Intwong et at, 1972, Reiginger et at, 1976 9. Zimmer and Pieper 1978, Ichihashi 1992 10. Homma and Asahira 1895, Lin 1986
11. Champagnat and Morel, 1969; Churchill et at, 1971,1973 12. Letham 1974, Van Standen and Drewes, 1975
13. Saprorhx-teahultum, 1953; Camphell, 1964 14. Irawati, Harjadi, Suseno and Idris, 1977 15. Fu, 1979, Holttumara Teo and Wong, 1978
16. Champagnat and Morel, 1969; Churchill et at, 1971,1973 17. Letham 1974, Van Standen and Drewes, 1975
Tài liệu Internet
1. http://d.violet.vn/uploads/resources/49/40388/preview.swf 2. http://www.vietnamplus.vn/Home/Nhan-giong-Lan-Ho-Diep-lai-bang- phuong-phap-moi/200910/22111.vnplus 3. http://www.hoalanvietnam.org/Article.asp?ID=18 4. http://www.nongsinh.com/Nhan_giong_vo_tinh_phong_lan_HoiNghi_ Dalat.pdf 5. http://www.hcmbiotech.com.vn/news_detail.php?cateid=10&id=835
6. http://www.hcmbiotech.com.vn/picture_center_detail.php?cateid=21&c urrent_page=3 7. http://www.hcmbiotech.com.vn/picture_center_detail.php?cateid=21&c urrent_page=3 8. http://www.tuvannongnghiep.com.vn/tintuc/default.aspx?cat_id=772& news_id=1847 9. http://dost.danang.gov.vn/default.php?Action=news_detail&idx=153 10.http://dost.danang.gov.vn/default.php?Action=news_detail&idx=153 11.http://www.longdinh.com/default.asp?act=chitiet&ID=4705&catID=6 12.http://maxreading.com/?chapter=31025 13.http://tintuc.xalo.vn/0016039246/thu_choi_lan_cua_nguoi_ha_noi.html 14.http://caucaquangbinh.com/home/index.php?option=com_content&vie w=article&id=858:lan-rng&catid=87:sinh-vt-cnh&Itemid=385
Lời Cảm Ơn
Để hoàn thành khoá luận này trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Ts. Hà Thị Thuý – phó trưởng phòng, phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp.
Tôi xin cảm ơn KS. Dương Minh Nga người đã gợi mở cho tôi những phương hướng nghiên cứu và đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập.
Tôi xin cảm ơn toàn thể các anh chị trong phòng thí nghiệm trọng điểm Viện Di Truyền Nông Nghiệp Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi trong quá trình thực tập.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tập thể cán bộ giáo viên Khoa CNSH Viện Đại Học Mở Hà Nội đã hướng dẫn giảng dạy và chỉ bảo tôi tận tình trong quá trình học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè những người luôn bên tôi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đã động viên khuyến khích tôi trong thời gian học tập để hoàn thành khoá luận này.
Hà Nội, ngày 02 tháng 04 năm 2010
Sinh viên thực hiện
CHỮ VIẾT TẮT VÀ MỘT SỐ THUẬT NGỮ
NCM : Nuôi cấy mô
2,4D : 2,4 dichorophenoxi acetic acid BAP : Benzyl Amino Purin
NAA : Naphtyl Acetid Axid GA3 : Acid Gibberellin
MS : Mura Shige & Skoog, 1962 CT : Công thức
TN : Thí nghiệm CTTD : Chỉ tiêu theo dõi
PLB : Protocorm like body là những thể có dạng tương tự Protocorm nhưng phát triển từ những phần mô khác nhau của Lan (ví dụ như lát cắt mô lá), không phải từ hạt.
Protocorm: Trong quá trình nảy mầm, hạt Lan chứa phôi tạo ra cấu trúc có dạng củ hoặc tiền chồi được gọi là Protocorm, mà từđó sẽ phát triển thành một cây hoàn thiện. Trong môi trường nuôi cấy in vitro, phần sinh dưỡng của nhiều loài Lan tạo ra Protocorm mềm, tròn, mà từ đó chúng có thể được nhân lên hoặc bật chồi thành một cây con. (Glossary ò biotechnology and genetic
engineering-FAO CORPORATE DOCUMENT REPOSITORY).
MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
Knudson C KC(1946)
Murashige and Shoog MS(1962)
Vacin and Went VW(1949)
CaCl2* 6 H2O 440 mg Ca(NO3)2 * 4 H2O 1000 mg Ca3(PO4)2 200 mg CoCl2 * 6 H2O 0,025 mg CuSO4 * 5 H2O 0,025 mg FeSO4 * 7 H2O 25 mg 27,8 mg