Mỗi ơ nhỏ có diện tich1/400mm2 và một ơ lớn là 1/25mm2. Bề dày của khoảng trống buồng đếm là 1/10mm. Do vậy, mỗi ơ lớn có thể tích là 1/250mm3
hay 1/250.10-3 = 4.10-6 ml.
Suy ra mật độ tế bào: N = 0,25a . 106 CFU/ml ( a là số tế bào bình qn trong một ơ lớn)
3.4.2. Định lượng tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang OD610nm3.4.2.1. Nguyên tắc 3.4.2.1. Nguyên tắc
Số lượng tế bào vi sinh vật trong mơi trường có thể được xác định một cách
gián tiếp nhờ phương pháp đo mật độ quang. Theo phương pháp này, số lượng
photon ánh sáng bị phân tán tỉ lệ thuận với lượng sinh khối tế bào có trong mẫu đem
đo (trừ những trường hợp mẫu có mật độ tế bào đậm đặc), hay trong những điều
kiện sinh trưởng nhất định thì tỉ lệ với mật độ tế bào.
3.4.2.2. Cách tiến hành
a. Thiết lập đường cong chuẩn
- Thực hiện pha loãng huyền phù tế bào sao cho thu được các huyền phù có OD610 là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5;… Dùng buồng đếm hồng cầu để xác định mật
độ tế bào tương ứng với các huyền phù có OD610 khác nhau.
- Xây dựng đường cong chuẩn biểu diễn mật tế bào (CFU/ml) theo độ hấp thu.
b. Xác định mật độ tế bào
- Với dịch huyền phù tế bào vi khuẩn cần xác định (huyền phù X), pha loãng dịch này (nếu cần thiết) đến các nồng độ khác nhau.
- Tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 610 nm trên máy đo mật độ quang. - Nếu trị số OD610 nhận được nằm ngoài vùng tương quan tuyến tính giữa mật
độ tế bào (CFU/ml) và OD610 thì tiến hành pha lỗng huyền phù này để có trị
số OD610 nằm trong vùng tuyến tính. Sử dụng đường cong chuẩn để suy ra
mật độ cần tìm. Trong trường hợp có pha lỗng thì mật độ tế bào cần tìm là mật độ tế bào suy ra từ đồ thị nhân với hệ số pha loãng.
3.4.3. Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc 3.4.3.1. Nguyên tắc 3.4.3.1. Nguyên tắc
Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành một
khuẩn lạc có thể trơng thấy được. Đây là cơ sở của việc định lượng tế bào trên thạch
đĩa, bởi vì số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định chỉ
số lượng tế bào sống có trong thể tích giống đó. Thơng thường, tất cả các tế bào ở
pha tăng trưởng hay ở giai đoạn sớm của pha ổn định đều có khả năng hình thành
khuẩn lạc. Vì vậy, số lượng khuẩn lạc đếm được gần như tương đương với số lượng tế bào sống.
3.4.3.1. Cách tiến hành
- Pha loãng mẫu: do chưa biết được nồng độ vi sinh vật trong mẫu, ta tiến
hành pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1; 10-2; 10-3; 10-4;…
- Nấu chảy môi trường NA đã hấp tiệt trùng, sau đó đổ vào đĩa petri đã khử
trùng, để nguội.
- Dùng pipet Pasteur hút 1 ml mẫu ở các độ pha loãng khác nhau cho vào các
đĩa petri chứa môi trường.
- Ni ủ ở nhiệt độ phịng trong vịng 24 giờ.
- Đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa. Chọn nồng độ pha lỗng có số khuẩn
lạc (A) nằm trong khoảng 20 ÷ 250.
- Tính số lượng tế bào sống (N) có trong 1ml mẫu như sau: N = A . d (CFU/ml)
Trong đó: A là số khuẩn lạc đếm được trên đĩa. d là số lần pha loãng.
3.5. Phương pháp đánh giá khả năng hấp phụ E.coli của bentonite 3.5.1. Khảo sát nồng độ bentonite ảnh hưởng đến khả năng hấp phụ
- Tiến hành hoạt hóa giống E.coli trong môi trường dinh dưỡng NB trong khoảng 10 ÷ 16 giờ.
- Pha loãng huyền phù vi khuẩn E.coli đến 10-1; 10-2; 10-3;…
- Tiến hành xác định số lượng tế bào trong dung dịch đã pha loãng bằng phương pháp đếm số lượng các khuẩn lạc.
- Hút 2 ml dung dịch có độ pha loãng là 10-3 cho vào các ống nghiệm, sau
đó cho bentonite thơ và các loại bentonite đã hoạt hóa vào từng ống
nghiệm với nồng độ khảo sát, lắc các mẫu trong khoảng thời gian xác
định, ở nhiệt độ 300C, sau đó đem ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút.
Dịch lỏng được tách ra khỏi bentonite và đem đi xác định số lượng vi
sinh vật còn lại bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
Hiệu suất của q trình hấp phụ E.coli tính (A) được tính như sau:
Trong đó: + C0 là mật độ vi khuẩn trước khi xử lý hấp phụ (CFU/ml) + C là mật độ vi khuẩn sau khi xử lý hấp phụ (CFU/ml)
Ngoài ra để đánh giá chính xác hiệu quả hấp phụ E.coli trên một lượng
bentonite xác định người ta dùng đại lượng Ai gọi là hiệu suất hấp phụ tính theo số lượng vi khuẩn bị hấp phụ trên 1g bentonite.
Với m là khối lượng bentonite (g)
3.5.2. Khảo sát thời gian tiếp xúc ảnh hưởng đến khả năng hấp phụ
- Tiến hành hoạt hóa giống E.coli trong môi trường dinh dưỡng NB trong khoảng 10 ÷ 16 giờ.
- Pha loãng huyền phù vi khuẩn E.coli đến 10-1
; 10-2; 10-3;…
- Tiến hành xác định số lượng tế bào trong dung dịch đã pha loãng bằng phương pháp đếm số lượng các khuẩn lạc.
- Hút 2 ml dung dịch có độ pha loãng là 10-3
cho vào các ống nghiệm,
sau đó cho bentonite thơ và các loại bentonite đã hoạt hóa vào từng
ống nghiệm với nồng độ bentonite xác định, các mẫu được lắc trong
khoảng thời gian khảo sát.
- Cứ sau một khoảng thời gian khảo sát thì tiến hành xác định số lượng vi sinh vật còn lại trong mỗi ống nghiệm cũng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
Hiệu suất của q trình hấp phụ tính (A) được tính như sau:
Trong đó: + C0 là mật độ vi khuẩn trước khi xử lý hấp phụ (CFU/ml) + C là mật độ vi khuẩn sau khi xử lý hấp phụ (CFU/ml)
CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả biến tính bentonite
Bentonite sau khi tinh chế được trao đổi với HCl 5%, HNO3 5%, NaOH và biến tính bằng nhiệt độ.
Những loại bentonite này được đem đi phân tích cấu trúc bằng nhiễu xạ tia X (XRD) tại phịng X-ray thuộc Phịng phân tích hóa lý – Viện Khoa học vật liệu
ứng dụng trên máy Siemens D5000 (Đức). Kết quả phân tích được biểu diễn từ hình
3.1 đến 3.5.
Hình 4.3. Giản đồ XRD của bentonite-HNO3 5%