- Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường YPDA + Khả năng phát triển
+ Hình dạng khuẩn lạc + Bề mặt khuẩn lạc + Màu sắc khuẩn lạc
2.2.2.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống
Cách tiến hành: lấy 1 phiến kính khô và sạch đặt lên giá đỡ, nhỏ 1 giọt nước sạch vô trùng lên giữa phiến kính. Dùng que cấy lấy một ít nấm men đã nuôi trên môi trường YPDA, đặt vào chỗ giọt nước trên phiến kính, trộn đều để tạo huyền phù. Đậy nhẹ lá kính, vừa đậy vừa kéo trên giọt dịch để tránh tạo thành bọt khí. Dùng khăn giấy lau nhẹ bề mặt lá kính cho khô.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc trên các điều kiện nuôi cấy khác nhau
Chủng nấm men sau khi được cấy trang trên các môi trường khác nhau, nuôi ở các nhiệt độ khác nhau. Sau 2 ngày, quan sát đặc điểm của khuẩn lạc hình thành.
2.2.4. Xây dựng đường cong sinh trưởng trên các môi trường khác nhau
Chủng nấm men được nuôi cấy trong các môi trường khác nhau để xây dựng đường cong sinh trưởng của chúng.
Lấy 1 vòng que cấy chủng nấm men cho vào môi trường lỏng khác nhau trong bình tam giác 500ml chứa 200ml môi trường. Đặt vào máy lắc với tốc độ 150 vòng/ phút, ở 25 – 27oC. Xác định giá trị OD ở thời điểm ban đầu và ở các thời gian tiếp theo, tiến hành đo OD trong khoảng 72 giờ.
Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang (OD600nm).
2.2.5. Phương pháp xác định lượng sterol trong màng tế bào
Nấm men được nuôi cấy trong bình tam giác 250ml chứa 100 ml môi trường YPD trên máy lắc với tốc độ 150 vòng / phút, 25oC. Sau 24 giờ, dịch nuôi cấy được đem đi ly tâm thu sinh khối, rửa 2 lần với nước cất, xác định khối lượng tế bào ướt.
Sử dụng n-heptan để tách chiết sterol và định lượng bằng phép đo quang phổ. Sterol tự do được tách chiết theo Shobayashi và cộng sự, 2005. Sterol tổng số được tách theo Mukhopadhyay và cộng sự, 2002. Hàm lượng sterol được xác định theo phương pháp quang phổ tại bước sóng 292nm. Đường chuẩn được xây dựng sử dụng ergosterol làm chất chuẩn.
2.2.6. Phương pháp xác định tính thấm của màng tế bào nấm men đối với chất kỵ nước β-carotene trên các điều kiện nuôi cấy được lựa chọn với chất kỵ nước β-carotene trên các điều kiện nuôi cấy được lựa chọn
Sinh khối nấm men thu được từ các môi trường nuôi cấy cho tiếp xúc qua đêm với β-carotene. Sau đó đem đi chiết và phân tích β-carotene trong tế bào nấm men. Dung môi tách chiết sử dụng là n-hexan. Hàm lượng β-carotene được xác định bằng phương pháp quang phổ tại bước sóng 450nm theo công thức sau:
Hàm lượng β-carotene (µg/g) = A450 *V*10000/ (2592*m) Trong đó:
A450: độ hấp thụ bước sóng tại 450nm V (ml): thể tích tách chiết
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu:
3.1.1. Quan sát đặc điểm hình thái của chủng nấm men
3.1.1.1. Chủng nấm men Y. lipolytica
3.1.1.1.1. Đặc điểm hình thái của Y. lipolytica trên môi trường YPDA
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy 2 chủng nấm men Y. lipolytica W29 và 0544 trên môi trường thạch YPDA ở nhiệt độ 27oC và quan sát hình thái của chúng sau 3 ngày. Kết quả thu được như sau:
+ Chủng W29: Hình dạng: Tròn Màu sắc: Màu đục Cấu trúc: Dạng khô Bề mặt: Lồi lõm
Khi làm tiêu bản quan sát tế bào nấm men Yarrowia lipolytica W29 dưới kính hiển vi (dưới vật kính 100) thấy các tế bào nấm men chủ yếu hình sợi dài, một số hình cầu hoặc hình trứng.
Hình 3.2: Hình thái tế bào Y. lipolytica W29 khi nuôi trên YPDA ở 27oC + Chủng 0544:
Hình dạng: Tròn Cấu trúc: Khô Bề mặt: Sần sùi Màu sắc: Đục
Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc Y. lipolytica 0544 trên môi trường YPDA ở 27oC.
Cũng giống như W29, tế bào của chủng 0544 cũng có hình sợi, hình cầu hoặc hình trứng.
3.1.1.2. Chủng nấm men S. cerevisiae
3.1.1.2.2. Đặc điểm hình thái S. cerevisiae trên môi trường YPDA
Trên môi trường YPDA, sau 3 ngày nuôi cấy ở 27oC, chủng nấm men S. cerevisiae có đặc điểm như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình dạng: Tròn
Cấu trúc: Đồng nhất, dạng bột nhão Bề mặt: Nhẵn bóng
Màu sắc: Màu trắng sữa đồng đều, thuần nhất
Hình 3.6: Hình thái tế bào của S. cerevisiae TNS.c trên môi trường YPDA ở 27oC. Khi quan sát bằng kính hiển vi (vật kính 100), tế bào nấm men S. cerevisiae có hình tròn hoặc bầu dục, có không bào.
3.1.2. Khảo sát khả năng sinh trưởng trên các môi trường khác nhau
Chủng Y. lipolytica và S. cerevisiae được cấy trang trên các môi trường YPDA, YPA, YPOA, YNBA, YNBOA, YNBDA, RDA, PDA lần lượt ở các nhiệt độ 20oC, 27oC, 30oC trong 3 ngày để khảo sát khả năng sinh trưởng của chúng trên các môi trường này.
3.1.2.1. Chủng Y. lipolytica W29
Kết quả sau 3 ngày nuôi cấy chủng Y. lipolytica W29 (bảng 3.1) và Y.lipolytica
0544 (bảng 3.2), đối với nguồn cacbon khác nhau thì chủng Y. lipolytica W29
phát triển được trong môi trường chứa đường, lipid hoặc tinh bột nhưng mức độ sinh trưởng khác nhau. Đối với các nguồn cacbon khác nhau thì khả năng phát triển trên môi trường có nguồn cacbon là glucose và lipid tốt hơn trên môi trường có nguồn cacbon là tinh bột. Cụ thể với 100µl dịch cấy với OD= 0,25 thì ở 27oC trên môi trường YPDA sau 48h nuôi cấy hình thành với 54 khuẩn lạc,
trên môi trường hình thành YPOA là 43 khuẩn lạc, trong khi trên môi trường PDA, số khuẩn lạc hình thành là 28, còn trên môi trường RDA chỉ có các chấm li ti. Với nguồn nitơ khác nhau: giàu dinh dưỡng (cao nấm men và pepton), nghèo dinh dưỡng (YNB) thì khả năng sinh trưởng trên môi trường giàu dinh dưỡng tốt hơn. Với môi trường không có nguồn cacbon YNBA thì chỉ hình thành vài khuẩn lạc với kích thước nhỏ.
Ở các nhiệt độ khác nhau, ở nhiệt độ 27oC nấm men này sinh trưởng tốt hơn 30oC và 20oC.
3.1.2.2. Chủng S. cerevisiae
Kết quả sau 3 ngày nuôi cấy chủng S. cerevisiae TNS.c (bảng 3.3), đối với nguồn cacbon khác nhau, chủng S. cerevisiae chỉ sinh trưởng được trong các môi trường có nguồn cacbon là đường, trên môi trường có nguồn cacbon là lipid chúng không có khả năng sinh trưởng, môi trường có nguồn cacbon là tinh bột thì khả năng sinh trưởng cũng tốt nhưng trên môi trường PDA tốt hơn trên môi trường RDA.
Trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau thì môi trường chứa cao nấm men và pepton sinh trưởng tốt hơn trên môi trường có chứa các acid amin cơ bản. Chủng này có khả năng sinh trưởng trong môi trường không có nguồn cacbon YNBA.
Ngoài ra, nhiệt độ nuôi cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của chúng, ở 30oC và 27oC tốt hơn ở 20oC, với việc hình thành các khuẩn lạc có kích thước to hơn và nhiều hơn khi nuôi trong cùng một điều kiện thời gian.
Bảng 3.1: Khả năng sinh trưởng của Y. lipolytica W29 trên các môi
trường khác nhau ở các nhiệt độ khác nhau
W29 20oC 27oC 30oC YPDA YPA YPOA YNBDA YNBA
YNBOA
PDA
Bảng 3.2: Khả năng sinh trưởng của Y. lipolytica 0544 trên các môi
trường khác nhau ở các nhiệt độ khác nhau
0544 20oC 27oC 30oC YPDA YPA YPOA YNBDA YNBA
YNBOA
PDA
Bảng 3.3: Khả năng sinh trưởng và phát triển của S. cerevisiae TNS.c trên
các môi trường khác nhau ở các nhiệt độ khác nhau
TNS.c 20oC 27oC 30oC YPDA YPA YPOA YNBDA YNBA
YNBOA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
PDA
3.1.3. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Y. lipolytica và S. cerevisiae trên các môi trường nuôi cấy khác nhau cerevisiae trên các môi trường nuôi cấy khác nhau
Chủng nấm men Y. lipolytica được nuôi cấy lần lượt trên các môi trường YPD, YPO, YNBO, YNBD và S. cerevisiae được nuôi ở các môi trường YPD, YNBD ở nhiệt độ 27oC, tốc độ lắc 150 vòng /phút để xây dựng đường cong sinh trưởng của chúng.
3.1.3.1. Y. lipolytica
Hình 3.7: Đường cong sinh trưởng của Y. lipolytica W29 trên một số môi trường Từ đồ thị ta thấy, sau khoảng 48 giờ nuôi cấy, chủng W29 phát triển tốt nhất ở trên môi trường YPD, trên môi trường YNBO phát triển yếu. Đồng thời cũng cho thấy là với nguồn cacbon là đường thì sẽ phát triển tốt hơn trên môi trường có nguồn cacbon là lipid, với nguồn nitơ là cao nấm men và pepton sẽ tốt hơn môi trường có nguồn nitơ là các acid amin cơ bản.
Trên môi trường có lipid như YPO, YNBO sau khoảng 24 giờ, quá trình sinh trưởng bước vào pha cân bằng, trong khi trong môi trường không có lipid như YPD, YNBD thì sau 19 giờ quá trình sinh trưởng đã bước vào pha cân bằng. Thời gian đi vào pha cân bằng của chủng trên môi trường có nguồn cacbon là
lipid lâu hơn là do chủng này phải mất thời gian để thực hiện quá trình hấp thụ vì các phân tử chất béo có ái lực lớn đối với lớp màng phospholipid nên việc nhả hấp phụ chúng khỏi màng tế bào sẽ lâu hơn.
Cũng tương tự như W29, trên YNBO khả năng sinh trưởng của 0544 yếu, còn trên ba môi trường YPD, YPO, YNBD khả năng sinh trưởng tốt.
Hình 3.8: Đường cong sinh trưởng của Y. lipolytica 0544 trên một số môi trường.
3.1.3.2. S. cerevisiae
Do chủng S. cerevisiae không có khả năng sinh trưởng trên môi trường có nguồn cacbon là lipid nên ở đây ta chỉ khảo sát khả năng sinh trưởng trên môi trường có nguồn cacbon là đường.
Hình 3.9: Đường cong sinh trưởng của S. cerevisiae TNS.c trên một số môi trường
Hình 3.10: Đường cong sinh trưởng của S. cerevisiae HNS.c trên môi trường YPD Sau khoảng 48 giờ nuôi cấy, khả năng sinh trưởng của chủng này trên 2 môi trường là như nhau. Thời gian bước vào pha cân bằng khoảng 19 giờ.
3.1.4. Khả năng thấm β-carotene qua màng tế bào
Chúng tôi nghiên cứu khả năng thấm qua màng của phân tử kỵ nước β- carotene trên 4 chủng nấm men W29, 0544, TNS.c và HNS.c cũng như ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới hiệu suất thấm. Sinh khối sau khi nuôi cấy và được thu tại thời điểm giữa pha log, được ủ với dầu carotene qua đêm. Khả năng
thấm qua màng tế bào được thể hiện qua hàm lượng carotene đi vào trong tế bào. Kết quả thu được như sau:
Hình 3.11: Hàm lượng β-carotene trên 1g sinh khối nấm men của 4 chủng. Khả năng thấm qua màng của carotene phụ thuộc vào chủng giống nấm men sử dụng.
Trên cùng môi trường nuôi cấy YPD, hai chủng Y. lipolytica cho kết quả tương tự nhau với hiệu suất chuyển chất đạt 1,1 – 1,2 (µg/g sinh khối ướt), cao gấp 1,7 lần hiệu suất chuyển chất của hai chủng S. cerevisiae (0,6 – 0,7 (µg/g sinh khối ướt). Như vậy, màng tế bào của chủng nấm men Y. lipolytica có tính thấm đối với β-carotene cao hơn màng tế bào của chủng S. cerevisiae.
Khi tiến hành thí nghiệm với hai chủng Y. lipolytica nuôi cấy trên môi trường sử dụng lipid làm nguồn cacbon, chúng tôi nhận thấy đối với cả hai chủng nấm men thí nghiệm, khả năng thấm β-carotene khi nuôi trên môi trường có lipid đều cao hơn khi nuôi trên môi trường glucose từ 5,5 – 5,9 lần đối với chủng 0544 và từ 2,3 tới 8,6 lần đối với chủng W29.
Như ta đã biết, Y. lipolytica có khả năng sử dụng các lipid để làm nguồn cacbon cho sinh trưởng tế bào. Điều này có thể giải thích khả năng hấp thụ các phân tử kỵ nước qua màng tế bào của Y. lipolytica cao hơn so với những chủng truyền thống như S. cerevisiae. Ngoài ra, khi nuôi cấy trên môi trường có lipid,
màng tế bào đã được thích nghi và thường có tính linh động cao hơn so với khi nuôi cấy trên môi trường glucose. Điều này có thể giải thích khả năng xâm nhập của một phân tử kỵ nước như β-carotene qua màng tế bào nuôi trên môi trường lipid sẽ dẽ dàng hơn khi xâm nhập qua màng tế bào nuôi trên môi trường glucose.
3.1.5. Xác định lượng sterol trong màng tế bào được nuôi cấy trên các môi
trường khác nhau
Trong tế bào nấm men, sterol tồn tại dưới dạng sterol tự do và dạng ester của nó (steryl). Dạng sterol tự do cư trú chủ yếu trong màng tế bào, trong các vi cấu trúc (raft) và chịu trách nhiệm điều hòa tính lỏng của màng. Hàm lượng sterol và tỷ lệ sterol tự do trong tế bào phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn chủng Y. lipolytica W29 để nghiên cứu hàm lượng sterol tự do cũng như tổng số khi nuôi cấy trên các môi trường khác nhau và tìm hiểu sự liên hệ giữa chúng tới tính thấm của màng tế bào đối với phân tử β-carotene.
Hình 3.12: Hàm lượng sterol trên các môi trường khác nhau (chủng Y. lipolytica W29) Kết quả cho thấy hàm lượng sterol tổng số thu được cao nhất trên môi trường YNBO, thấp nhất trên môi trường YPD; đồng thời sterol tự do chiếm
96% đối với môi trường YPD, 63% đối với môi trường YNBO và 56% đối với môi trường YPO.
Sterol có vai trò như chất điều hòa tính lỏng của màng tế bào. Khi bổ sung sterol vào màng tế bào sẽ làm cho màng trở nên lỏng hơn. Tuy nhiên, tới một giới hạn nào đó, khi hàm lượng sterol tăng thì màng tế bào chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái đông rắn. Điều này được chứng minh khi đo tính linh động của màng tế bào sử dụng phương pháp mồi huỳnh quang (Tạ và cộng sự, 2010). Điều này cũng có thể giải thích khả năng xâm nhập dễ dàng của β- carotene qua màng tế bào trong trường hợp nuôi trên môi trường YNBO.
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Đã tiến hành mô tả hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào của các chủng Y. lipolytica và S. cerevisiae. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Đã xây dựng đường cong sinh trưởng của các chủng Y. lipolytica và S. cerevisiae trên các môi trường nuôi cấy khác nhau, xác định được thời gian để chủng nấm men đi vào pha cân bằng trên môi trường có nguồn cacbon là lipid khoảng 24 giờ, trên môi trường có nguồn cacbon là đường khoảng 19 giờ.
3. Quá trình phân tích sterol trên màng, chúng tôi nhận thấy rằng % sterol tự do của chủng nấm men trên môi trường có nguồn cacbon là đường sẽ nhiều hơn % sterol của chủng nấm men nuôi trên môi trường có nguồn cacbon là lipid. Kết quả phân tích hàm lượng β-carotene thấm qua màng tế bào trên môi trường có nguồn cacbon là lipid cao hơn trên môi trường có nguồn cacbon là đường. Hàm lượng β-carotene thấm qua màng này phụ thuộc vào nồng độ sterol trong tế bào.
KIẾN NGHỊ
1. Ngoài yếu tố môi trường nuôi cấy, có thể khảo sát thêm các yếu tố ngoại cảnh như: pH, oxy, nhiệt độ… đến việc hình thành sterol trên màng.
2. Khảo sát trên nhiều chủng nấm men hơn để có những đánh giá tổng quát hơn về tính chất bề mặt của màng tế bào.
3. Đánh giá thêm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới tính toàn vẹn cũng như trao đổi điện tử trong màng.
4. Đối với chủng Y. lipolytica có khả năng sử dụng nguồn cacbon là lipid, có thể nghiên cứu để sử dụng chủng nấm men này trong xử lý ô nhiễm các chất thải dầu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Như Hiền, Trịnh Xuân Hậu (2006): Giáo trình sinh học tế bào, nhà xuất bản Giáo Dục.
2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyền, Phạm Văn Ty (2002): Vi sinh vật học, nhà xuất bản Giáo Dục.
3. Lương Đức Phẩm (2006): Nấm men công nghiệp, nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật.
Tiếng Anh
1. Michel E van der Rest et al., 1995, The plasma membrane of
Saccharomyces cerevisiae, Vol 59, 304 – 318.
2. Thi Minh Ngoc Ta et al., 2010, New insights into effect of medium- chain-length lactones on yeast membranes. Importance of the culture medium, Appl Microbiol Biotechnol, Vol. 87, No. 3, 1089-1099.
3. France Thevenieau et al., 2009, Applications of non-conventional yeast
Yarrowia lipolytica, 590 – 610.