- Phần mềm Microsoft Excel 2003 được sử dụng để nhập liệu và tính các thông số cơ bản, phần mềm Minitab 16 được sử dụng trong phân tích ANOVA để tính sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Cặp dòng vi khuẩn và thời gian cho hiệu suất đông tụ cao nhất
Bốn dòng vi khuẩn KG.05, VL.05, VL.01, ST.02 được tổ hợp thành 6 cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.05, KG.05-VL.01, KG.05-ST.02, VL.01-VL.05, VL.05-ST.02, VL.01-
ST.02 để kiểm tra thời gian đông tụ tốt nhất của các cặp dòng vi khuẩn. đồng thời dựa vào thí nghiệm này có thể chọn được cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Hiệu suất đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn được ghi nhận tại năm móc thời gian 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ (bảng 4 ).
Bảng 4. Hiệu suất đông tụ ở những thời điểm khác nhau của các cặp dòng vi khuẩn.
KG05-VL05 28.32 52.94 77.42 58.58 15.72 46.60 KG05-VL01 48.81 65.41 88.23 66.49 25.18 58.82 KG05-ST02 42.91 55.61 71.2 47.82 17.41 46.99 VL01-VL05 34.37 57.82 81.73 50.74 26.15 50.16 VL05-ST02 44.57 53.69 63.06 49.06 15.02 45.08 VL01-ST02 25.61 53.78 69.97 42.17 27.65 43.84 TB hiệu suất 37.43 56.54 75.27 52.48 21.19
Từ kết quả thống kê, có thể kết luận rằng các cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy 99%. Cụ thể là, trung bình hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01 tại các thời điểm là 58.82% khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê và cao nhất so với các cặp dòng vi khuẩn còn lại.
Hiệu suất đông tụ ở các móc thời gian khác biệt có ý nghĩa ở mức 1%. Trong đó, tại móc thời gian 6 giờ, trung bình hiệu suất đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn cao nhất là 75.27% và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các móc thời gian còn lại.
Qua phân tích ANOVA ta có thể nhận định, thời gian đông tụ và sự tổ hợp của các dòng vi khuẩn có sự tương tác qua lại khi tác động lên hiệu suất đông tụ. Tại móc thời gian 6 giờ có 3 cặp dòng vi khuẩn: KG05-VL05 (77.42%), KG05-VL01 (88.23%), VL01- VL05 (81.73%) đều có hiệu suất đông tụ cao và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức tin cậy 99% so với tất cả các cặp dòng vi khuẩn và các móc thời gian còn lại. Nhưng khi so sánh hiệu suất đông tụ của 3 cặp dòng vi khuẩn ở móc 6 giờ thì sự khác biệt giữa chúng không có ý nghĩa về mặt thống kê, nên cả ba cặp dòng vi khuẩn này được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo cùng với thời gian đông tụ cao nhất là 6 giờ.
Hình 6. Hiệu suất đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn ở sáu thời điểm.
Sự đông tụ giữa các cặp dòng vi khuẩn có liên quan đến thời gian tương tác của chúng, điều này được chứng minh qua nhiều nghiên cứu: McNab và Jenkinson (1998) kiểm tra hiệu suất đông tụ của ba cặp dòng vi khuẩn khác nhau về mặt di truyền. Kết quả sự đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn này không bị mất đi trong trong quá trình phát triển. Rickard et al. (2000) theo dõi sự đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn tổ hợp từ các dòng
B. natatoria 2.1; B. natatoria 2,6; B. natatoria2,3; M. luteus 2.13. Kết quả là thời gian đầu, sự đông tụ của các cặp vi khuẩn không đáng kể hoặc không diễn ra, đến một thời điểm hiệu suất đông tụ tăng đến một giá trị tối đa, tùy thuộc vào từng cặp dòng vi khuẩn, sự đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn được duy trì cho đến 50 giờ, sau đó các cặp dòng vi khuẩn tách nhau ra, quá trình đông tụ dừng lại. Kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng đông tụ của 6 cặp dòng vi khuẩn ở các móc thời gian khác nhau là phù hợp với các nghiên nghiên cứu trước đây. Hiệu suất đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn ở giai đoạn đầu còn thấp, sau đó tăng dần và đạt cao nhất tại thời điểm 6 giờ; thời gian khảo sác tiếp theo, hiệu suất đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn giảm xuống thấp, thấp nhất là 15.02% (VL05- ST02), gần như không đáng kể (hinh).
Ba cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.05, KG.05-VL.01, VL.01-VL.05 có hiệu suất đông tụ cao được sử dụng để kiểm tra tác động của yếu tố pH đến quá trình đông tụ ở 7 mức giá trị: 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 tại móc thời gian 6 giờ cho sự đông tụ đạt tối ưu.
Bảng 5. Hiệu suất đông tụ ở những giá trị pH của các cặp dòng vi khuẩn.
KG05-VL05 32.92 41.82 51.79 56.88 72.17 53.96 34.36 49.13
KG05-VL01 29.25 43.59 51.72 61.39 76.13 59.50 37.33 51.27
VL01-VL05 26.26 31.86 49.04 58.31 69.81 49.37 27.38 44.58
29.48 39.09 50.85 58.86 72.70 54.28 33.02
Kết quả phân tích ANOVA cho thấy, hiệu suất đông tụ giữa các cặp dòng vi khuẩn khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy 99%, kết quả này phù hợp với thí nghiệm 1. Cặp dòng vi khuẩn KG05-VL01 có hiệu suất đông tụ trung bình cao nhất (51.27%) ở tất cả giá trị pH và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với 2 cặp dòng vi khuẩn còn lại.
Trung bình hiệu suất đông ở giá trị pH = 7 của 3 cặp dòng vi khuẩn đạt cao nhất (72.17%) và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 1%. Hiệu suất đông tụ của 3 cặp dòng vi khuẩn thấp nhất là 29.48% khi pH = 3, kế đến là 33.02% khi pH = 9, ≥ 54.28 khi pH nằm trong khoảng 6 đến 8. Từ đây có thể kết luận, các cặp dòng vi khuẩn có thể hoạt động trong môi trường có pH từ 3 đến 9, và hoạt động tốt nhất ở giá trị pH = 7.
Trong tương tác giữa pH và cặp dòng vi khuẩn cùng ảnh hưởng lên hiệu suất đông tụ, cho kết quả cao nhất là 76.13% của cặp KG05-VL01 ở pH = 7, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 1%. Vậy nên, Cặp dòng vi khuẩn KG05-VL01, và pH = 7 được chọn để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả của Min et al., (2010) khi khảo sát yếu tố pH ảnh hưởng lên hiệu suất đông tụ của các dòng vi khuẩn đồng đông tụ trong bùn hoạt tính. Chúng có thể hoạt động trong môi trươngd có pH từ 3 đến 9. Theo Kimchhayarasy et al., (2009) pH = 7 là giá trị tối ưu cho các dòng vi khuẩn đông tụ được phân lập trong bùn hoạt tính.
Hinh. Hiệu suất đông tụ ở những giá trị pH của các cặp dòng vi khuẩn. 4.3. Ảnh hưởng của các cation
Cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01, thời gian cho tổ hợp hai dòng vi khuẩn là 6 giờ, và pH=7 được chọn qua 2 thí nghiệm trên để tiến hành thực hiện kiểm tra ảnh hưởng của 4 loại : cation Ca2+, Mg2+, K+, Na+, mỗi loại khảo sát ở 6 nồng độ: 10mM, 20nM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM của các loại muối tương ứng: CaCl2, MgCl2, KCl, NaCl.
Bảng 6. Ảnh hưởng của các cation ở các nồng độ khác nhau đến hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01. NaCl KCl CaCl MgCl 10 43.12 46.94 42.93 53.59 46.65 20 53.64 52.79 69.1 71.83 61.84 30 71.63 69.64 57.07 62.95 65.32 40 51.52 35.84 49.67 46.96 46.00 50 48.08 33.33 42.35 44.46 42.06 60 33.79 29.6 41.48 41.03 36.48 50.30 44.69 50.43 53.47
Từ kết quả phân tích có thể nhận định, các loại cation (loại muối) ảnh hưởng khác nhau đến hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01 có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức tin cậy 99%. Trong đó, sự hiện diện của Mg2+ cho hiệu suất đông
tụ cao nhất (53.47%) so với các loại cation còn lại và hiệu suất đông tụ thấp nhất là 44.69% dưới sự tác động của cation K+.
Nồng độ của các loại muối cũng có những tác động khác nhau đến hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 1%. Trong tất cả các trung bình của từng nồng độ tính trên cả 4 loại muối, nồng độ cho hiệu suất đông tụ cao nhất (65.32%) là 30mM, thấp nhất (36.48%) ở nồng độ 60mM.
Qua phân tích ANOVA có thể nhận định, các nồng loại muối khác nhau sẽ có một nồng độ tối ưu cho hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01. Cụ thể là, 2 muối cation hóa trị II: CaCl2 và MgCl2 có hiệu suất đông tụ cao nhất, khác biệt có ý nghĩa với mức tin cậy 99%, (tương ứng là 57.07%; 62.95%) ở nồng độ 20mM so với các nồng độ muối còn lại; 2 muối có cation hóa trị I: KCl và NaCl có hiệu suất đông tụ cao nhất (tường ứng là 69.64%; 71.63%) khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nồng độ muối còn lại. Ở các nồng độ muối ban đầu thấp 10mM (và 20mM đối với cation hóa trị I) hiệu suất đông tụ chưa tối ưu nhất, cho đến khi tăng nồng độ muối đến giá trị phù hợp đối với từng muối. Và tiếp tục, nồng độ các muối được nâng lên 40mM, 50mM, 60mM hiệu suất đông tụ có những biến động theo chiều hướng giảm (hình), và thấp nhất là ở nồng độ muối 60mM. Nguyên nhân là do, sự thay đổi nồng độ hay điện tích ion trong môi trường sẽ làm thay đổi cấu trúc bề mặt tế bào dẫn đến sự đông tụ bị ảnh hưởng. Hơn nữa liên kết giữa các dòng vi khuẩn là nhờ liên kết lectin-olygosaccharide, protein lectin chiệu sự tác động của điện tích trong môi trường nên nồng độ muối cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn.
Kết quả này là phù hợp với nghiên cứu của Min et al., (2010) khi khảo sát các yếu tố hóa, lý ảnh hưởng đến sự đông tụ của 2 dòng vi khuẩn Sphingomonas natatoria 2.1gfp và Micrococcus luteus 2.13 trong bùn hoạt tính của nước thải sinh hoạt. Tế bào vi khuẩn được pha loãng trong các dung dịch có nồng độ khác nhau của các muối CaCl2, MgCl2, MgSO4 và NaCl, KCl, sự đông tụ bị hạn chế khi nồng độ muối NaCl, KCl (cation hóa trị 1) ở 90 mM, trong khi đó nồng độ các muối CaCl2, MgCl2, MgSO4 (cation hóa trị 2) chỉ cần 40 mM.
Muối cation hóa trị I: NaCl và KCl, cation cation hóa trị II: CaCl2, MgCl2 tương ứng có hiệu suất đông tụ cao nhất ở nồng độ 30mM, 20mM khác biệt có ý nghĩa với mức tin cậy 99% so với các nồng độ còn lại. Nhưng khi so sánh giữa chúng với nhau thì sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên, mỗi dòng vi khuẩn sẽ phù hợp với một loại ion ở nồng độ nhất định để hoạt động tối ưu nhất (Theo Lương Đức Phẩm, 2009), trong khi đó, môi trường nước thải chăn nuôi heo tồn tại rất nhiều các loại ion hóa trị I, II. Vì thế, thí nghiệm tiếp được thực hiện để tìm ra loại cation có nồng độ tối ưu được
Muối NaCl
KCl
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Hồ Thanh Tâm và Cao Ngọc Điệp. 2013. Vi khuẩn đông tụ (Aggregation) trong nước thải trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí khoa học, Đại học Cần Thơ.
Lương Đức Phẩm. 2009. Công nghệ xử lý nước thải bằng biện pháp sinh học, NXB Giáo dục Việt Nam.
Nguyễn Thị Hồng, Phạm Khắc Liệu. 2012. Đánh giá hiệu quả xử lý nước thải chăn nuôi lợn bằng hầm Biogas quy mô hộ gia đình ở Thừa Thiên Huế. Tạp chí khoa học, Đại học Huế, (73)4: 81-91..
Trần Thị Thu Hiền. 2012. Chọn hổn hợp vi khuẩn Bacillus đối kháng Vibrio. Luận văn tốt nghiệp đại học, trường đại học Cần Thơ, trang 3.
Tiếng Anh
Gibbons, R. J., M. Nygaard. 1970. Inter-bacterial aggregation of plaque bacteria. Arch Oral Biol, 15: 1397-1400.
Kolenbrander, P.E. and R.N. Anderson. 1989. Inhibition of coaggregation between
Fusobacterium nucleatum and Porphyromonas gingivalis by lactose and related sugars. Infect Immun, 57: 3204-3209.
Kolenbrander, P.E., J. London. 1993. Adhere today, here tomorrow: oral bacterial adherence. J Appl Bacteriol, 175: 3247-3252.
Kimchhayarasy, P., K. Kakii and T. Nikata. 2009. Intergeneric coaggregation of non- flocculating Acinetobacter spp. isolates with other sludge-constituting bacteria,
Journal of Bioscience and Bioengineering, VOL. 107 No. 4, 394-400.
Malik, A. and K. Kakii. 2003. Pair dependent co-aggregation behavior of nonflocculating sludge bacteria. Biotechnol Lett, 25: 981-986.
Malik, A., M. Sakamoto, S. Hanazaki, M. Osawa, T. Suzuki, M. Tochigi, and K. Kakii. 2003. Coaggregation among nonflocculating bacteria isolated from activated sludge.
Appl Environ Microbiol, 69: 6056-6063.
Malik, A., M. Sakamoto, T. Ono and K. Kakii. 2003. Coaggregation between
Acinotobacter johnsonii S35 and Microbacteria esteraromaticum strains isolation from sewage activated sludge. Bioscience and Bioengineering, 96: 10-15.
Min, K.R. and A.H. Rickard. 2009. Coaggregation by the Freshwater Bactetium Sphingomonas natatori Alters Dual-Species Biofilm Formatio. Appl Environ Microbiol, pp 3985 - 3997.
Min, K.R., M.N. Zimmer and A.H.Rickard. 2010. Physicochemical parameters influencing coaggregation between the freshwater bacteria Sphingomonas natatoria
2.1 and Micrococcus luteus 2.13. Biofouling, 26: 931-940.
Ngo, M.J. 2010. Coaggregation and Biofilm formation by bacteria isolated from chronic wounds. Master of Philsophy.
Sakka, K., T. Endo, M. Watanabe, S. Okuda, and H. Takahashi. 1981. Deoxyribonuclease-susceptible floc forming Pseudomonas sp. Agric Bio. Chem, 45: 497-504.
Singh, G. et al.. 2013.Poly β–Hydroxybutyrate production by Bacillus subtilis NG220 using sugar industry waste water. Biomed Research International.
Shalini, P., L. Sadhana, C. Simrita and C.K. Vipin. 2009. Phylogeny in aid of the present and novel microbioal lineages: diversity in Bacillus. PloS ONE.
Vandevoorde, L., H. Christiaens, W. Verstraete. 1992 Prevalence of coaggregation reactions among chicken lactobacilli. J Appl Bacteriol, 72: 214-219.
Trang web http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus. (ngày 31/12/2013). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2698354/#r28. (ngày 31/12/2013). http://www.congnghemoitruong.net/so-luoc-nuoc-thai-chan-nuoi-va-qua-trinh-xu-ly.html. (ngày 4/1/2014). http://microwavesscience.blogspot.com/2011/05/biofilms-at-11.html. (ngày 5/1/2014). http://microwavesscience.blogspot.com/. (ngày 6/1/2014). http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1097. (ngày 6/1/2014). http://moitruonghaidang.com/cong-nghe-xu-ly-nuoc-thai-chan-nuoi-heo/. (ngày 7/1/2013). http://www.epe.edu.vn/images/news/QCVN%2024-2009.pdf. (ngày 7/1/2014). http://sonongnghiepbp.gov.vn/index.php?language=vi&nv=cnty&op=Cong-nghe/Cong- nghe-xu-ly-nuoc-thai-trong-chan-nuoi-heo-35. (ngày 17/2/2014).
Costerton JW, Lewandowski Z., Caldwell DE, Korber DR, Lappin-Scott HM Microbial biofilms. Annu. Rev Microbiol.1995; 49 . :711-745
Sutherland I.W. Biofilm exopolysaccharides: A strong and sticky framework. Microbiology. 2001;147:3–9.
EPSs (exopolysaccharides) là thành phần cấu tạo giúp ổn định cấu trúc không gian của vi khuẩn.
McNab R, Jenkinson H F. Altered adherence properties of a Streptococcus gordonii hppA (oligopeptide permease) mutant result from transcriptional effects on cshA adhesin gene expression. Microbiology. 1998;144:127–136
Coaggregation between Aquatic Bacteria Is Mediated by Specific-Growth-Phase- Dependent Lectin-Saccharide Interactions
Alex H. Rickard, Stephen A. Leach, Clive M. Buswell, Nicola J. High, Pauline S. Handley
Thời gian OD KG05-VL05 KG05-VL01 KG05-ST02 VL01-VL05 VL05-ST02 VL01-ST02 1 Giờ OD0 0.286 0.279 0.294 0.289 0.292 0.288 0.291 0.286 0.297 0.276 0.288 0.295 0.295 0.293 0.299 0.296 0.286 0.296 ODs 0.208 0.181 0.171 0.146 0.160 0.211 0.206 0.196 0.174 0.152 0.166 0.222 0.211 0.186 0.163 0.142 0.154 0.221 3 Giờ OD0 0.267 0.248 0.265 0.269 0.290 0.271 0.296 0.262 0.298 0.287 0.282 0.297 0.284 0.248 0.286 0.292 0.295 0.289 ODs 0.120 0.103 0.123 0.092 0.132 0.126 0.14 0.116 0.122 0.122 0.143 0.134 0.139 0.101 0.131 0.079 0.126 0.136 6 Giờ OD0 0.263 0.256 0.263 0.252 0.288 0.276 0.252 0.295 0.263 0.279 0.293 0.263 0.252 0.278 0.284 0.244 0.272 0.286 ODs 0.055 0.028 0.078 0.051 0.112 0.087 0.055 0.039 0.077 0.053 0.102 0.097 0.063 0.031 0.078 0.038 0.101 0.062 9 Giờ OD0 0.289 0.318 0.321 0.306 0.297 0.326 0.342 0.365 0.355 0.334 0.312 0.319 0.298 0.318 0.313 0.365 0.321 0.343 ODs 0.125 0.167 0.184 0.112 0.145 0.187 0.129 0.179 0.173 0.101 0.166 0.177 0.129 0.147 0.158 0.123 0.163 0.208 12 Giờ OD0 0.396 0.433 0.463 0.472 0.389 0.466 0.398 0.449 0.462 0.462 0.389 0.466 0.377 0.467 0.487 0.485 0.373 0.482 ODs 0.328 0.344 0.395 0.356 0.325 0.337 0.342 0.329 0.372 0.336 0.334 0.337 0.317 0.335 0.399 0.356 0.319 0.349
Two-way ANOVA: HieuSuat versus ViKhuan, ThoiGian
Source DF SS MS F P ViKhuan 5 2230.0 446.01 45.71 0.000 ThoiGian 4 29976.2 7494.04 767.98 0.000
Interaction 20 2274.5 113.73 11.65 0.000 Error 60 585.5 9.76
Total 89 35066.2
S = 3.124 R-Sq = 98.33% R-Sq(adj) = 97.52%
Kết quả phân tích mối tương quan hai nhân tố bằng phần mềm Minitab 16
General Linear Model: Hiệu Suất versus Vi Khuẩn, Thời Gian