Mục đích: xác định giá trị pH tối ưu nhất để hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn ở thời điểm tối ưu đạt được cao nhất.
Qua thí nghiệm 1, cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao nhất tại thời gian tối ưu cho sự đông tụ được chọn để tiến hành kiểm tra khả năng đông tụ dưới sự ảnh hưởng của các giá trị pH khác nhau.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần lập lại, 1 nhân tố tác động là pH với 7 mức: 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9. Tổng cộng số nghiệm thức là 7, số đơn vị thí nghiệm là 21.
Các bước tiến hành:
- Nhân sinh khối mỗi dòng vi khuẩn trong bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường trong 24 giờ.
- Chuẩn bị dịch vi khuẩn đối mỗi giá trị pH:
+ 300ml dung dịch muối (3 mM NaCl + 0.5 mM CaCl2) được chuẩn bị và điều chỉnh pH về giá trị đang khảo xác.
+ 50 ml dịch nhân sinh khối vi khuẩn của mỗi dòng được rút vào tube eppendorf 2 ml và ly tâm 11000 vòng/phút trong 10 phút.
+ Sinh khối tế bào được rửa 2 lần với dung dịch muối (3 mM NaCl + 0.5 mM CaCl2). Và chứa trong dung dịch muối này trong bình tam giác có dung tích 250 ml, sau đó thêm dung dịch muối đến 50 ml và lắc đều.
+ 50ml dịch muối chứa vi khuẩn được chuyển vào tube eppendorf 2 ml , ly tâm nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút. 1.5 ml dịch vi khuẩn lơ lửng phía trên mỗi tube được chuyển vào bình tam giác có dung tích 250 ml và điều chỉnh OD660 = 0.3.
- Phối trộn vi khuẩn: đối với mỗi giá trị pH, các dòng vi khuẩn sau khi được chuẩn bị riêng biệt được tổ hợp thành từng cặp dòng vi khuẩn chứa trong bình tam giác 150 ml, mỗi dòng sử dụng 20 ml ,sau đó, đặt trên máy lắc 120 vòng/phức ở 300C.
- Kiểm tra chỉ số OD: đến thời điểm sự đông tụ đạt tối ưu (đã xác định ở thí nghiệm 1), sử dụng micropipett rút 1.5 ml dịch vi khuẩn đo OD660, Sau 10 phút để yên, dịch vi khuẩn được cho vào tube ly tâm 700 vòng/phút trong 2 phút, 1.5 ml dịch vi khuẩn phía trên được hút bằng micropipett để đo OD660.