V. QUI TRÌNH PCR PHÁT HIỆN GEN KHÁNG KHÁNG SINH
6. TIẾN HÀNH KỸ THUẬT PCR 1 Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR [11]
6.1. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR [11]
6.1.1. Cách pha mồi (primers) cho phản ứng PCR:
Mồi oligonucleotide để phát hiện ba gen pbp được thiết kế để khuếch đại các bộ phận(phần) của gen pbp1a , 2x và 2b chỉ trong những chủng nhạy cảm. Những bộ phận này được đặt vào trong các đơn vị của các chuỗi phân nhánh cao được xác định trong gen khảm pbp của S. pneumoniae không nhạy cảm penicillin .
Một hỗn hợp mồi A có mồi để phát hiện Lyta và gen pbp1a, hỗn hợp mồi B có mồi để phát hiện gen pbp2x và 2b, và hỗn hợp mồi C chứa mồi cho phát hiện gen mef (A) và erm (B). Mỗi hỗn hợp mồi: có 100 μL, trong đó:
• Mồi: 0,1 μM mỗi mồi; • dNTPs: 8 mM;
• Đệm: 50 μl của 10 × đệm PCR có: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.4, 1.5 mM MgCl2;
• Enzyme: 20 U của Tth DNA polymerase;
• Nước: 348 μl của dH2O, được thêm vào mỗi hỗn hợp mồi.
• Sau đó, nó được chia thành các phần phân ước 30 μl và bảo quản ở -30 ° C.
6.1.2. Điều kiện PCR
- Một khuẩn lạc duy nhất của S. pneumoniae phát triển trên một đĩa thạch máu đã được huyền phù trong 30 μl dung dịch ly giải. Các thành phần của dung dịch ly giải đã được báo cáo trước đây. Các ống nghiệm với các dd ly giải đã được thiết lập thành một chu trình nhiệt (GeneAmp
51SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung, Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung, Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH
9700; PE Applied Biosystems, Foster City, California, Hoa Kỳ) và ủ ở 60 ° C trong 10 phút và 94 ° C trong 5 phút. Những lysates sau đó được sử dụng như là một DNA mẫu cho PCR. - Tiếp theo, 2 μl của lysate vi khuẩn được thêm vào mỗi ba ống có chứa các hỗn hợp mồi A, B và C. Một kiểm sốt dương tính và âm tính đã được bao gồm trong mỗi lần chạy.
- PCR được thực hiện với chu trình nhiệt trong: 30 chu kỳ ở 94 ° C trong 15 giây, 30 chu kỳ ở 53 ° C trong 15 giây và 30 chu kỳ 72 ° C trong 15 giây.
- Sau khi khuếch đại, 10 μl của mỗi của ba sản phẩm PCR được điện di trên agarose gel 3% (Agarose LE; Promega Công ty Madison, WI, Mỹ) trong 40 phút ở 100 V.
- Chú ý: Tất cả các mồi sử dụng cho mPCR có nhiệt độ ủ gần như giống hệt nhau, làm giảm sự xuất hiện của các băng khơng mong muốn có nguồn gốc từ khuếch đại không đặc hiệu.
6.2. Thực hiện phản ứng PCR trên máy luân nhiệt [11]
Các bước Nhiệt độ Thời gian
Biến tính 940C 5 phút
Biến tính 940C 15 giây
Gắn mồi 530C 15 giây 30 chu kỳ
Tổng hợp 720C 15 giây
Kết thúc 720C 5 phút
6.3. Điện di sản phẩm PCR [12]:
52SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung, Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung, Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH
Tóm tắt:
Chuẩn bị gel agarose 3% [11]:
– Cần cho đủ lượng thạch (agar) vào dung dịch TAE 1X, lắc đều và đun hòa tan thạch bằng lị vi sóng.
– Để thạch nguội khoảng 50-60oC đổ khuôn tạo gel. Nhỏ mẫu:
– Đặt bản gel vào buồng điện di có dung dịch đệm TAE 1X.
– Rỏ 10µl thang ADN chuẩn 100bp và các sản phẩm PCR vào các giếng thạch. Chạy điện di: Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút.
Nhuộm và chụp ảnh gel:
– Nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide (0.5 μg/ml) trong 30 phút rồi rửa bằng nước cất trong 15 phút(2).
– Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp gel BioDoc-itTM System. 7. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
- Có vạch trên gel và đúng kích thước khi so sánh với thang ADN chuẩn vạch có hình ảnh rõ nét, đẹp.
Ví dụ: ta có kết quả điện di như hình sau [11];
53SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung, Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung, Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH
Kết quả của các đoạn DNA khuếch đại kiểm sốt dương tính bao gồm trong bộ (giếng 1-3) và ba chủng thử nghiệm (giếng 4-12). Đánh dấu PCR (Promega) đã được sử dụng như tiêu chuẩn kích thước trong giếng được đánh dấu 'Mr' (thang chuẩn). Sản phẩm PCR của Lyta (sản phẩm 319 bp) và pbp1a (sản phẩm 195 bp ) được thể hiện trong giếng 1, 4, 7 và 10. Sản phẩm của pbp2x (sản phẩm 197 bp ) và pbp2b (sản phẩm 147 bp ) được thể hiện trong giếng 2, 5, 8 và 11. mef (A) (sản phẩm 402 bp ) và erm (B) (sản phẩm 224 bp ) được thể hiện trong giếng 3, 6, 9 và 12.
- Nếu vạch mờ, không rõ: o Tăng thể tích điện di.
o Thực hiện lại phản ứng PCR.
- Các mẫu xét nghiệm được xác định dương tính khi xuất hiện các vạch có kích thước tương ứng với các mẫu chứng và thang chuẩn ADN, ghi: (+).
- Các mẫu khơng có vạch hoặc có vạch khơng đúng kích thước được coi là âm tính, ghi (-).
TÀI LIỆU THAM KHẢO