Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa của dê tạ
* Đề xuất biện pháp phòng trị bệnh sán dây cho dê.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa của dê tại tỉnh Bắc Giang Bắc Giang
2.4.1.1. Điều tra thực trạng cơng tác phịng chống bệnh giun, sán đường tiêu hóa cho dê tại tỉnh Bắc Giang
Phỏng vấn các hộ nuôi dê trên địa bàn nghiên cứu và ghi phiếu điều tra về việc thực hiện các biện pháp phịng chống bệnh giun, sán đường tiêu hóa cho dê.
2.4.1.2. Phương pháp nghiên cứu nhiễm các lồi giun, sán đường tiêu hóa dê a. Phương pháp điều tra dịch tễ
Sử dụng phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang và nghiên cứu can thiệp (Nguyễn Như Thanh và cs. 2001 [22]).
* Dung lượng mẫu:
- Mẫu phân dê được thu thập theo phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc tại 5 huyện của tỉnh Bắc Giang (Yên Thế, Lạng Giang, Lục Nam, Lục Ngạn và Sơn Động). Mỗi huyện lấy ở 5 xã, mỗi xã lấy ở 3 thôn, tại mỗi thôn lấy mẫu ngẫu nhiên.
Dung lượng mẫu phân cần thu thập được tính bằng phần mềm dịch tễ học Winepiscope 2.0, với tỷ lệ nhiễm giun, sán dự đoán là 50%, độ tin cậy 95%,
- Số lượng dê đã thu thập mẫu phân là 1977 con, mổ khám 200 con, số lượng mẫu ở các huyện cụ thể như sau:
STT Huyện Dê thu thập mẫu phân
(con) Số dê mổ khám (con) 1 Yên Thế 422 43 2 Lạng Giang 325 32 3 Lục Nam 362 36 4 Lục Ngạn 456 47 5 Sơn Động 412 42 Tổng 1977 200
* Số dê thu thập mẫu theo các nội dung nghiên cứu như sau: - Tuổi dê:
Tuổi dê được phân ra làm 4 lứa tuổi, số mẫu phân thu thập ở các lứa tuổi như sau: Dê ≤ 3 tháng tuổi: 347 con.
Dê > 3 - 6 tháng tuổi: 632 con. Dê > 6 - 12 tháng tuổi: 519 con. Dê > 12 tháng tuổi: 479 con. - Giống dê:
Tỉnh Bắc Giang ni chủ yếu có 3 giống dê (dê Cỏ, dê Bách Thảo và dê Boer). Số lượng như sau:
Dê Cỏ (giống dê địa phương): 759 con.
Dê Bách Thảo (giống dê lai giữa dê Alpine của Pháp và dê British - Alpine của Ấn Độ): 527 con.
Dê Boer (giống dê nhập từ Mỹ): 691 con. - Phương thức chăn nuôi:
+ Chăn nuôi truyền thống (mỗi nông hộ chăn nuôi 5 - 10 con dê, chủ yếu tận dụng nguồn thức ăn sẵn có và phế phụ phẩm của ngành trồng trọt, chuồng trại rất đơn sơ): 982 con.
+ Chăn nuôi bán công nghiệp (mỗi nông hộ chăn nuôi từ 10 - 50 con; thức ăn nuôi dê gồm các loại thức ăn tự nhiên sẵn có, các phế phụ phẩm của ngành trồng trọt và kết hợp với thức ăn công nghiệp; chuồng trại xây dựng chắc chắn, cao ráo sạch sẽ, có rãnh thốt nước): 995 con.
- Số dê thu thập phân ở các mùa trong năm: + Mùa Xuân (tháng 2 đến tháng 4): 479 con. + Mùa Hè (tháng 5 đến tháng 7): 536 con. + Mùa Thu (tháng 8 đến tháng 10): 564 con.
+ Mùa Đông từ tháng 11 đến tháng 1 năm sau: 398 con.
b. Phương pháp mổ khám, thu thập và định loại giun, sán đường tiêu hóa ở dê * Phương pháp mổ khám, thu thập giun, sán đường tiêu hóa dê
Để tìm giun, sán ký sinh ở hệ tiêu hố, tiến hành mổ khám cơ quan tiêu hóa của dê theo phương pháp mổ khám toàn diện một cơ quan của Skrjabin (1928) với
mục đích: xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm giun, sán; những biến đổi đại thể và vi thể của cơ quan tiêu hóa dê do giun, sán gây ra.
Cách mổ khám và thu thập giun, sán: dùng kéo nhọn, sắc cắt dọc theo đường tiêu hóa, kiểm tra tất cả các phần: thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già, manh tràng, gan và tụy. Thu lượm giun, sán trong chất chứa ở mỗi phần (bằng phương pháp lắng cặn chất chứa) và những giun, sán cịn bám trên niêm mạc đường tiêu hóa.
Mỗi loại sán lá, sán dây, giun trịn ở mỗi phần của cơ quan tiêu hóa đều được để riêng. Mẫu vật giun, sán của mỗi dê cũng được để riêng. Trước hết để chúng chết tự nhiên trong nước sạch; sau đó sán lá, sán dây và ấu trùng sán dây được bảo quản trong cồn 70o; giun tròn được bảo quản trong dung dịch barbagallo.
Để định loại sán dây bằng kỹ thuật sinh học phân tử, 5 mẫu sán dây thu được từ dê và 5 mẫu sán dây thu từ bị ni tại Bắc Giang được để trong lọ nước cất, bảo quản ở nhiệt độ - 20oC.
Cách ghi nhãn mổ khám:
Số thứ tự dê: Ngày mổ khám:
Giống: Số lượng giun, vị trí ký sinh:
Tuổi: Số lượng sán, vị trí ký sinh:
Địa điểm mổ khám: Sơ bộ định danh:
Phân loại sơ bộ các loài giun, sán đã thu thập được dưới kính lúp và kính hiển vi, căn cứ vào hình thái, cấu tạo của giun, sán trưởng thành.
Việc xác định chính xác thành phần lồi giun, sán ở đường tiêu hố dê được thực hiện tại Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
c. Phương pháp chuẩn bị giun, sán và định loại
+ Chuẩn bị giun, sán
- Các mẫu giun tròn sau khi thu thập bảo quản trong dung dịch barbagallo, mẫu sán bảo quản trong cồn 70o.
- Đối với sán lá và sán dây được nhuộm carmin. Đầu sán dây được ngâm trong dung dịch lactophenol cho đến khi trong, dễ quan sát.
- Đối với giun tròn: ngâm trong dung dịch lactophenol để làm trong cơ thể giun, dễ quan sát cấu tạo của giun.
- Tách mẫu: tách những con sán mà cơ thể có đầy đủ các bộ phận (đầu, cổ, thân). - Chọn những mẫu sán đẹp nhất có cấu tạo đầy đủ (đầu, cổ, thân, đốt già). - Rửa mẫu trong nước cất với thời gian 10 - 15 phút.
- Ép mẫu: đặt mẫu vào giữa hai lam kính để ép cho mẫu thẳng, các mẫu khác làm tương tự, sau đó ngâm trong nước với thời gian 15 phút, sau 15 phút mở ra từ từ.
- Mẫu sán lấy ra từ cồn 70o được cho vào thuốc nhuộm Carmin 10 - 15 phút, rồi chuyển lần lượt sang cồn 70o, 80o, 96o, 100o với thời gian mỗi lần 15 - 30 phút (tùy kích thước từng mẫu); sau đó làm trong bằng xylen.
- Chuẩn bị lamen và lam kính, nhỏ 1 - 2 giọt Baume canada lên lam kính, sau đó lấy bút lơng, gắp sán đặt lên giọt Baume canada, đậy lamen lên. Sau một ngày soi kính hiển vi kiểm tra cấu tạo của sán.
- Sau khi làm xong mẫu, điền đầy đủ thông tin về mẫu lên lam kính. + Định loại
- Tiến hành định loại giun sán theo khóa định loại của Skrjabin và Petrov (1963) [19]; Phan Thế Việt và cs (1977) [26], Nguyễn Thị Lê và cs (1996) [15].
- Đối với giun tròn: sau khi đã làm trong, quan sát đầu, miệng, phễu miệng, gai cổ, túi đầu, thực quản; túi đuôi, gai giao hợp đối với giun đực; âm hộ, cơ quan thải trứng đối với giun cái.
- Đối với sán lá: quan sát, giác bám, ruột, tinh hoàn, buồng trứng, tử cung, tuyến nỗn hồng trên tiêu bản nhuộm carmin.
- Đối với sán dây: quan sát đầu sán sau khi đã làm trong về giác bám, số lượng móc, hình dạng móc. Trên tiêu bản các đoạn sán dây nhuộm carmin, quan sát buồng trứng, tinh hoàn, túi trứng, chỗ đổ của lỗ sinh dục; đặc biệt là quan sát sự khác nhau của tuyến giữa đốt để phân biệt các loài thuộc giống Moniezia.
Sau khi phân loại xong, ghi rõ loài, số lượng, nơi ký sinh, địa điểm, ngày tháng mổ khám.
Kết quả định loại được ghi vào sổ mổ khám.
Mẫu vật giun, sán được bảo quản tại phịng thí nghiệm thú y - Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang.
d. Phương pháp thu thập và xét nghiệm mẫu phân
- Phương pháp lấy mẫu phân
Mẫu phân được lấy trực tiếp từ trực tràng dê, hoặc lấy mẫu phân dê mới thải ra, mỗi mẫu có khối lượng khoảng 20 - 30 gam. Đựng mẫu trong lọ nhựa có nắp hoặc túi nilon, có nhãn ghi các thơng tin: số thứ tự dê, tên chủ hộ, địa chỉ, tuổi dê, giống dê, phương thức chăn nuôi, thời gian lấy mẫu và các biểu hiện lâm sàng của dê (nếu có).
Các mẫu lấy xong được xét nghiệm ngay trong ngày, hoặc bảo quản phân bằng cách nhỏ vào mẫu phân 1 giọt formol 10% và tiếp tục bảo quản trong điều kiện lạnh 4 - 8oC, với thời gian không quá 3 ngày.
- Xét nghiệm phân dê bằng 3 phương pháp
+ Phương pháp lắng cặn (Benedek, 1943): dùng nước sạch để tách trứng sán lá, giun sán trưởng thành, hoặc đốt sán dây ra khỏi phân; do tỷ trọng của chúng lớn hơn tỷ trọng của nước nên chúng sẽ lắng xuống.
+ Phương pháp Fulleborn: lợi dụng tỷ trọng của dung dịch nước muối bão hòa (1,18 - 1,20), lớn hơn tỷ trọng của trứng giun, sán làm cho trứng giun, sán nổi lên bề mặt dung dịch.
+ Phương pháp phân ly ấu trùng giun có sức gây bệnh: ni cấy trứng giun tròn trong phân dê theo phương pháp Brumpt, để ở nhiệt độ 25 - 27oC. Phân ly ấu trùng theo phương pháp của Vaida, kiểm tra dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần để phân biệt hình thái ấu trùng.
e. Phương pháp xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm giun, sán
Tỷ lệ nhiễm được xác định bằng số dê nhiễm giun, sán trong tổng số dê xét nghiệm phân.
Cường độ nhiễm giun, sán qua mổ khám được xác định bằng cách đếm số lượng giun, sán ký sinh ở mỗi dê trong quá trình mổ khám và định loại.