ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.1.2. Xác định vi nấm:
Bệnh phẩm đã lấy được ở các vị trí: dịch nội khí quản, máu, đầu catheter…được giữ trong ống nghiệm vô trùng gửi ngay đến phòng XN. Tại phòng XN, bệnh phẩm được tách làm hai phần để: soi trực tiếp và cấy trong môi trường CHROMagar Candida…
2.1.1.2.1.Soi trực tiếp (soi tươi tìm nấm):
- Kỹ thuật : Nhỏ NaCl 0,9%, đậy la men. Sau đó, soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại 20 và 40 lần để phát hiện tế bào nấm, sợi nấm và các thành phần khác. Phải soi ít nhất 30 vi trường mà không thấy sợi nấm, đoạn nấm hoặc tế bào nấm thì mới kết luận là khơng thấy nấm.
- Đọc kết quả:
Xác định nấm gây bệnh thuộc nấm Candida khi thấy:
o Các tế bào nấm men nhỏ, kích thước từ 2-4µm hình trái xoan, có thể có chồi, thành mỏng.
o Sợi nấm giả có độ dài khác nhau, đầu tận cùng trịn đường kính khoảng 3- 5µm. Các sợi nấm có khoảng 1 hoặc 2 đốt, ở chỗ nối giữa hai đốt có thể thấy vài chồi.
Xác định nấm gây bệnh thuộc nấm Aspergillus :
o Sợi nấm : có vách ngăn, đính bào đài, mọc vng góc với sợi nấm, trên một tế bào nâng đỡ.
o Bào tử nấm : đính thành từng chuỗi, bào tử thành nhẵn hoặc thơ ráp, có gai, hình cầu hoặc elip.
Xác định nấm gây bệnh thuộc nấm Penicillium marneffei
o Lưỡng dạng : sợi nấm có vách ngăn, hoặc tế bào nấm men ở trong hoặc ngồi tổ chức bào, hình oval, kéo dài có thể tới 8 µm, đầu trịn có dạng xúc xích, có vách ngăn ở giữa.
o Bào tử : hình thành đính trên cuống dạng hình chai.
2.1.1.2.1.Cấy nấm:
Kỹ thuật chuẩn đoán nấm Candida :
Trên môi trường CHROMagar Candida, bản chất giống môi trường Sabouraud, nhưng có thêm các cơ chất nhân tạo(chất sinh màu) trong môi
trường. C.albicans, C.tropicalis, C.krusei sinh ra các enzyme đặc hiệu, giáng hóa, giải phóng các hợp chất màu khác nhau. Căn cứ vào sự biến đổi màu để xác định tên các chủng Candida này.
- Thành phần môi trường: Thạch 15g/l; peptone 10,2g/l; Hồn hợp sinh màu 22g/l ; chloramphenicol 0,5g/l ; pH 6,1 ± 0,2.
- Kỹ thuật :
+ Để đĩa thạch CHROMagar Candida vào tủ ấm 37˚C khoảng 5 - 10 phút cho đĩa thạch ấm đều.
+ Sau đó, tiến hành cấy bệnh phẩm vào đĩa thạch. Đầu tiên đốt dầu ăng, để nguội, ria một vùng nguyên ủy nhỏ và đều, sau đó tiến hành cấy phân vùng từ vùng nguyên ủy ban đầu.
+ Để đĩa thạch trong tủ ấm từ 30 – 37˚C trong vòng 24 – 48giờ.
- Sau 48 giờ đọc kết quả: nếu khơng có nấm mọc là kết quả ấm tính. Nếu có khuẩn lạc mọc thì căn cứ vào màu sắc khuẩn lạc để định chủng nấm.
TT Màu khuẩn lạc Chủng Candida Cách đọc khác
1 Xanh lá cấy C.albicans C.albicans
2 Xanh xám C.tropicalis C.spp
3 Hồng nhạt với viền màu trắng
C.krusei
4 Trắng đến hồng Chủng khác
Kỹ thuật chẩn đoán Aspergillus :
- Môi trường : Czapek-Dox.
- Thành phần : đường kính 30g, thạch 15g, NaNO3 …. - Ni cấy ở nhiệt độ phòng, theo dõi trong thời gian 7 ngày.
- Khi nấm phát triển : quan sát tốc độ phát triển của khuẩn lạc, hình dạng đại thể, vi thể của khuẩn lạc, biến đổi màu sắc môi trường để định danh.
- Môi trường : Saboraud.
- Thành phần : Thạch 15g/l; peptone 10,2g/l…
- Nuôi cấy : lấy bệnh phẩm từ các bệnh phẩm khác nhau cho vào đĩa thạch Saboraud, để tủ ấm 37˚, theo dõi hàng ngày. Nếu có khóm nấm mọc thì cấy chuyển sang Saboraud ống, để ra nhiệt độ thường(20˚C - 25˚C).
- Sau 2 – 3 ngày nếu khóm nấm chuyển màu kem sang màu ‘hồng’, lấy soi tươi ở vật kính 40x, xác định tế bào nấm men sắc tố ‘hồng’ và sợi nấm ‘hình chổi’.