CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.3.9. Phương pháp thử nghiệm chế phẩm synbiotic trên chuột thí nghiệm
Nguyên tắc: cho chuột thử nghiệm dùng synbiotic qua đường uống trong cùng
47
Thực hiện: thử nghiệm trên 10 chuột (50% đực, 50% cái), nhịn đói ít nhất 12 giờ
trước khi cho uống mẫu thử liều duy nhất tối đa qua đường uống với thể tích tối đa 50 ml/kg. Theo dõi và ghi nhận cử động tổng quát, biểu hiện về hành vi, trạng thái lông, ăn uống, bài tiết nước tiểu và số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ. Nếu sau 72 giờ, chuột khơng có dấu hiệu bất thường hoặc chết, tiếp tục theo dõi trong vòng 14 ngày [7, 10].
2.3.9.2. Khảo sát tác động điều trị tiêu chảy cấp của chế phẩm synbiotic
Khảo sát tác động điều trị tiêu chảy cấp của chế phẩm synbiotic trên mơ hình chuột nhắt gây tiêu chảy do kháng sinh: Chuột đực khỏe mạnh, bình thường, được chia ngẫu nhiên vào các lơ (8 chuột/lô): chứng sinh lý (lô 1: SL), chứng bệnh (lô 2: CB), đối chiếu Bioflora (lô 3: ĐC) và lô mẫu thử (lô 4: Thử). Chuột ở lô 2, 3 và 4 được gây tiêu chảy bằng cách cho uống hỗn hợp kháng sinh streptomycin liều 2 g/kg và lincomycin liều 3 g/kg, 2 lầnmỗi ngày trong 4 ngày liên tục, thể tích cho uống 10 ml/kg. Sau 4 ngày, toàn bộ chuột thử nghiệm được cho uống hỗn hợp kháng sinh đều có triệu chứng tiêu chảy: phân mềm/lỏng, số lần đại tiện tăng, có thể có tình trạng bị dính bẩn ở hậu mơn. Từ ngày 5, chuột lô đối chiếu được cho uống Bioflora liều 0,067 viên/kg/ngày; lô mẫu thử được cho uống synbiotic liều 1,2 g/kg/ngày; chuột lô chứng bệnh được cho uống nước cất trong 7 ngày liên tục, 2 lần mỗi ngày. Trong 7 ngày điều trị, lô 2 đến lô 4 tiếp tục được cho uống hỗn hợp kháng sinh với liều bằng ¼ liều ban đầu để hạn chế sự tự hồi phục. Lô chứng sinh lý được cho uống nước muối sinh lý trong suốt thử nghiệm. Ghi nhận trọng lượng cơ thể và đánh giá tình trạng tiêu chảy của chuột thử nghiệm hàng ngày theo tiêu chuẩn trong bảng 2.5 [30, 95, 166].
Bảng 2.5.Thang điểm đánh giá tiêu chảy ở chuột
Thang điểm Tình trạng tiêu chảy
0 Bình thường
1 Phân mềm và khơng có tình trạng dính bẩn ở hậu mơn.
2 Phân mềm/lỏng, màu nhạt, có tình trạng dính bẩn ở hậu mơn.
2.3.9.3. Khảo sát khảnăng kích thích miễn dịch của chế phẩm synbiotic
Khảo sát khả năng kích thích miễn dịch (tăng cường miễn dịch) của chế phẩm synbiotic trên mơ hình chuột nhắt gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid [18, 19]. Chuột đực, khỏe mạnh, được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 8 chuột:
48
- Lô trước thử nghiệm: lấy máu tim, gửi mẫu xác định cơng thức bạch cầu tại phịng khám Đa khoa Medlatec.
- Lô 1 (sinh lý): cho chuột uống nước cất; Lô 2 (chứng bệnh): cho chuột uống nước cất; Lô 3 (đối chiếu): chuột được tiêm phúc mạc Filgrastim liều 50 µg/kg; Lơ 4 (mẫu thử): cho chuột uống synbiotic với liều dùng 1,2 g/kg/ngày, 2 lần mỗi ngày.
Lô 1 (sinh lý) được tiêm phúc mạc NaCl 0,9%, thể tích 10 ml/kg. Chuột từ lơ 2 đến lơ 4 được tiêm phúc mạc bằng dung dịch cyclophosphamid (CYP) pha trong NaCl 0,9% với liều duy nhất 150 mg/kg vào ngày 1, thể tích tiêm 10 ml/kg. Chuột ở lô 3 được tiêm phúc mạc bằng filgrastim (pha trong glucose 5%), liều 50 µg/kg, hàng ngày từ ngày 2 đến ngày 5, liều đầu tiên cách 24 giờ sau khi tiêm CYP. Chuột ở lô 4 được cho uống mẫu synbiotic hàng ngày từ ngày 1 đến ngày 5. Chuột ở các lô thử nghiệm được ghi nhận trọng lượng hàng ngày trước khi uống mẫu thử. Vào ngày 5, sau khi tiêm filgrastim hoặc uống mẫu thử 1 giờ, gây mê chuột bằng đá CO2, lấy máu tim để xác định cơng thức bạch cầu tại phịng khám Medlatec; tách lấy lách, tuyến ức, gan và tuyến thượng thận, rửa bằng NaCl 0,9% lạnh, thấm khôcân và ghi nhận trọng lượng, xác định khối lượng tương đối của các cơ quan theo công thức:
g% = 𝑃𝑐𝑞
𝑃𝑐𝑡 ∗ 100
Trong đó: Pcq: trọng lượng cơ quan (g) Pct : trọng lượng cơ thể (g)
2.3.9.4. Khảo sát độc tính bán trường diễn
Nguyên tắc: Đánh giá độc tính bán trường diễn của chế phẩm synbiotictrên chuột nhắtbằng cách cho chuột thử nghiệm uốngliều dự kiến dùng cho người và liều cao gấp 2 lần liều dùng cho người(liều dự kiến sẽ quan sát được biểu hiện ngộ độc trên cơ quan của động vật thử nghiệm) trong khoảng thời gian 14 và 28 ngày. Thử nghiệm được tiến hành song song với 1 nhóm chứng sinh lý trong cùng điều kiện [7, 10].
Thực hiện: chuột (50% đực, 50% cái) mua về, được ni ở điều kiện thí nghiệm
trong 5 ngày, sau đó chia ngẫu nhiên thành 7 lô, mỗi lô 10 con (5 đực, 5 cái) nuôi riêng lẻ đực, cái trong 2 bocal nhựa.
49
Bảng 2.6. Phân lô thử nghiệmđộc tính bán trường diễn
TT Tên lơ Số chuột Thực nghiệm
1 Sinh lý trước thí
nghiệm 10 (5 đực, 5 cái)
Nuôi ổn định 5 ngày, giết mổ, khảo sát các chỉ số của chuột trước thử nghiệm
2 Sinh lý sau 14 ngày (SLa)
10 (5 đực, 5 cái)
Cho uống nước cất với liều 0,1 ml/10g/ngày trong 14 ngày liên tục
3 Mẫu thử liều 1,2 g/kg
sau 14 ngày (Thử 1a) 10 (5 đực, 5 cái)
Cho uống chế phẩm synbiotic với liều 1,2 g/kg/ngày, 2 lần/ngày (tương đương với liều điều trị dự kiến ở người) trong 14 ngày liên tục
4 Mẫu thử liều 2,4 g/kg
sau 14 ngày (Thử 2a) 10 (5 đực, 5 cái)
Cho uống chế phẩm synbiotic với liều 2,4 g/kg/ngày, 2 lần/ngày (gấp 2 lần liều điều trị dự kiến ở người) trong 14 ngày liên tục 5 Sinh lý sau 28 ngày
(SLb)
10 (5 đực, 5 cái)
Cho uống nước cất với liều 0,1 ml/10g/ngày trong 28 ngày liên tục
6 Mẫu thử liều 1,2 g/kg
sau 28 ngày (Thử 1b) 10 (5 đực, 5 cái)
Cho uống chế phẩm synbiotic với liều 1,2 g/kg/ngày, 2 lần/ngày (tương đương với liều điều trị dự kiến ở người) trong 28 ngày liên tục
7 Mẫu thử liều 2,4 g/kg
sau 28 ngày (Thử 2b) 10 (5 đực, 5 cái)
Cho uống chế phẩm synbiotic với liều 2,4 g/kg/ngày, 2 lần/ngày (gấp 2 lần liều điều trị dự kiến ở người) trong 28 ngày liên tục Cho chuột uống nước cất hoặc mẫu thử mỗi ngày, 02 lần/ngày vào buổi sáng (khoảng 9 giờ - 10 giờ) và buổi chiều (khoảng 15 giờ - 16 giờ) liên tục trong 14 ngày (lô SLa, Thử 1a, Thử 2a) hoặc 28 ngày (lơ SLb, Thử 1b, Thử 2b), thể tích cho uống 10 ml/kg. Theo dõi chuột trong quá trình thử nghiệm về: hành vi (tăng đi lại, giảm đi lại, nằm im, run rẩy, co giật…); lông (mượt, dựng đứng, rụng…) và các cơ quan: mắt, mũi…; tình trạng ăn, uống; tính chất phân, nước tiểu, thể trọng. Sự thay đổi trọng lượng cơ thể chuột được ghi nhận bằng cách cân chuột 1 lần/tuần vào ngày thứ 2.
Sau 14 hoặc 28 ngày, chuột được gây mê bằng đá CO2, mổ nhanh để lấy máu tim để thực hiện xét nghiệm các chỉ số huyết học như số lượng hồng cầu (RBC), bạch cầu (WBC), tiểu cầu (PLT), huyết sắc tố hemoglobin (HGB), dung tích hồng cầu hematocrit (HCT), thể tích trung bình một hồng cầu (MCV), số lượng hemoglobin trung bình trong một hồng cầu (MCH), nồng độ hemoglobin trung bình trong một hồng cầu (MCHC) và
50
khoảng phân bố hồng cầu (R khơ) (kiểm tra chức năng tạo máu), sinh hóa: aspartat aminotransferase (AST) và alanin aminotransferase (ALT), blood urea nitrogen (BUN), creatinin, kiểm tra chức năng gan, thận bằng máy xét nghiệm sinh hóa tự động RX Daytona (Randox, Vương quốc Anh) tại Bộ mơn Sinh hóa, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.
Vào ngày 28, tách lấy gan và thận, rửa sạch bằng nước muối sinh lý lạnh. Thấm khô. Quan sát đại thể, ghi nhận màu sắc, tình trạng bề mặt, tổn thương. Sau đó, ngâm gan, thận trong dung dịch formol 10 % và lấy ngẫu nhiên 6 mẫu gan, thận trong 1 lơ thí nghiệm để làm xét nghiệm vi thể sau khi nhuộm hematoxylin-eosin (HE) và quan sát trên kính hiển vi quang học (Labomed, Hoa Kỳ) tại Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quận 2, Tp. Hồ Chí Minh.
Nếu trong q trình thử nghiệm có chuột tử vong thì xem xét tình trạng của cơ quan nội tạng qua giải phẫu (đại thể và nhuộm tiêu bản HE, phân tích vi thể).