3.3.1 Phương pháp thu mẫu
Mẫu cá đã thu từ tháng 10 năm 2010 đến tháng 09 năm 2011. Mẫu cá đã thu từ các nghề khai thác như lưới cào, giăng lưới, giăng câu, đặt dớn, chài, đặt lợp…và thu từ các chợ lân cận.
Số mẫu thu được: Cá lóc đen đã thu 46 mẫu (tại Thốt Nốt – Cần Thơ), cá lóc bông đã thu 50 mẫu (tại Tam Nông – Đồng Tháp)
Đối với cá dày thì thu mẫu tại thị xã Vị Thanh – Hậu Giang. Số mẫu đã thu được là 355 mẫu trong suốt 12 tháng, mỗi tháng 30 mẫu để xem sự tăng trưởng của tuyến sinh dục và sự tăng trưởng của đá tai.
Mẫu sau khi thu đã được ướp lạnh bảo quản và vận chuyển về phòng thí nghiệm của Khoa Thủy Sản trường Đại học Cần Thơ để nghiên cứu phân tích.
3.3.2 Phương pháp định danh và phương pháp lấy đá tai
Phương pháp định danh: Đo các chỉ tiêu về hình thái (chiều dài (cm), khối lượng (g),...). Định danh loài cá theo khóa phân loại loài của Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993 (Phụ lục 1).
Phương pháp lấy đá tai: Dùng cưa sắt (đối với cá trưởng thành) hoặc có thể dùng dao mổ (đối với cá nhỏ) cắt ngay chính giữa đỉnh đầu của cá. Khi cắt gần chạm hộp sọ của cá thì dùng tay tách hộp sọ của cá ra. Sau khi hộp sọ của cá được tách ra thì dùng kẹp di chuyển phần óc ra ngoài. Kế tiếp, dùng kim mũi nhọn lấy đá tai ra ngoài. Đá tai được lấy ra ngoài sẽ được rửa sạch với cồn Ethanol 700 và lưu trữ bằng giấy chuyên dụng, sau đó bỏ vào tuýp Eppendoff 1,5 ml để đi phân tích.
Hình 3.2: Phương pháp lấy đá tai của các loài cá lóc
3.3.3 Phương pháp theo dõi sự phát triển tuyến sinh dục của cá dầy
Quan sát tuyến sinh dục của cá để phân biệt giới tính, phương pháp thường được áp dụng là quan sát bằng mắt nếu cần thiết thì có thể sử dụng kính lúp. Thông thường, tinh sào có dạng dẹp và quăn dợn song trong khi noãn sào có dạng ống, màu hồng nhạt và có hạt. Màu sắc của tuyến sinh dục cũng là một đặc điểm quan trọng để xác định giới tính đối với cá chưa thành thục, tinh sào thường có màu trắng hay xám, trong khi đó noãn sào thường có màu hồng nhạt hay hơi đỏ. Để khảo sát sự phát triển tuyến sinh dục qua các giai đoạn thì sử dụng kính hiển vi để quan sát là chính xác nhất.
Phương pháp theo dõi sự phát triển tuyến sinh dục của cá dầy dựa vào bậc thang thành thục sinh dục cho cá đẻ trứng theo Qasim (1957) Crossland (1977) như sau: Bảng 3.1: Bậc thang thành thục sinh dục cho cá đẻ trứng theo Qasim (1957) Crossland (1977) Giai đoạn Mức độ thành thục Mô tả I Chưa thành thục
Tuyến sinh dục dài khoảng 1/3 chiều dài xoang bụng. Noăn sào như một dăy băng mỏng, màu hồng nhạt, khó nhận thấy bằng mắt thường. Tinh sào là một sợi mảnh màu trắng.
II Trưởng thành
Tuyến sinh dục chiếm khoảng ½ thể tích xoang bụng. Noăn sào có màu hồng nhạt, hơi đục, co thể nhbn thấy các hạt trứng bằng kính lúp. Tinh sào có màu trắng như kem và dày lên.
III Đang chín
Tuyến sinh dục chiếm khoảng 2/3 xoang bụng. Trứng to và dễ dàng nhbn thấy bằng mắt thường. Noăn sào có màu hồng nhạt đến vàng. Tinh sào phát triển to ra, có màu trắng nhạt đến màu kem.
IV Chín muồi
Tuyến sinh dục chiếm hầu hết thể tích xoang bụng. Noãn sào căng phồng với trứng to và trong mờ. Tinh sào to, mềm có màu trắng kem.
V Thoái hóa
Tuyến sinh dục có nhiều khoảng trống rỗng và bắt đầu co lại. Noăn sào còn sót lại vài trứng chín có màu sậm hay trong mờ. Tinh sào mềm nhũn.
Ngoài ra, để xác định các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục, ta có thể quan sát mô của tuyến sinh dục dưới kính hiển vi. Phương pháp xử lý mẫu mô tuyến sinh dục gồm các bước sau: cố định mẫu, cắt tỉa định hướng mẫu, khử nước, ngấm vào trong paraffin, đúc khối, cắt lát mỏng, dán lát cắt vào phiến kính và nhuộm màu.
Cố định mẫu: Sau khi thu mẫu tinh sào cần phải đo chiều dài (mm), cân khối
lượng (g) và cho vào dung dịch Bouin trong thời gian 12h và sau đó chuyển sang cố định trong cồn 700. Buồng trứng sau khi thu cũng cần phải cân và đo sau đó xẻ dọc
để cho dung dịch cố định thấm vào. Dung dịch Bouin được pha gồm các dung dịch sau: Dung dịch axit picric bão hòa 750 mL, formol 40% 250 mL và Acid acetic 50 mL. Việc bảo quản trứng có thể thực hiện trong dung dịch formol – saline (Hancock, 1979)(trích dẫn bởi Phạm Thanh Liêm và Trần Đắc Định, 2004). Dung dịch này có thể chuẩn bị bằng cách pha 100 mL formol 40% với 900 mL nước cất và bổ sung thêm 100 g muối (sodium chloride).
Cắt tỉa định hướng mẫu: Mẫu mô đã cố định thường phải được cắt tỉa trước khi
đúc khối. Việc cắt tỉa được cắt bằng lưỡi dao cạo hoặc dao mổ để đạt được kích cở mong muốn.
Sau đó loại nước, làm trong mẫu và ngấm paraffin. Quá trình loại nước được thực
hiện bằng cách nhúng mẫu mô qua một loạt các dung dịch cồn (ethanol) với các nồng độ gia tang (10% cho mỗi bước) từ cồn 50% đến 80%, sau đó nhúng mẫu vài lần trong cồn 95% và cuối cùng là chuyển sang cồn 100%. Sau khi hoàn thành quá trình khử nước, cồn cũng cần phải loại ra khỏi mẫu mô bởi vì cồn không thể hòa lẫn với paraffin (Drury và Wallington 1980, Gabe 1976). Do đó cần làm ngấm vào trong mẫu mô một loại dung môi trung gian có thể hòa tan được paraffin và cồn. Quá trình này gọi là quá trình làm trong mẫu. Mục đích chính của bước này là dùng dung môi hòa tan paraffin để đẩy cồn ngấm trong mô ra. Dung môi thường được sử dụng là xylen, toulen, benzen…Mẫu mô cần ngâm trong dung môi từ 30 phút đến 2 giờ. Sau khi làm trong, mẫu mô sẽ được chuyển sang bước ngấm paraffin. Mẫu được ngâm trong các lọ paraffin nóng chảy (570 – 600) với thời gian thay đổi từ 1 đến 3 giờ tùy theo kích thước mẫu mô.
Cắt mẫu: Trước khi cắt mẫu, mẫu mô phải được giữ chặt trong một khung cố định,
thường thì đặt trong khung bằng paraffin. Mẫu mô đã được ngấm paraffin tốt sẽ được đặt trong khuôn bằng nhựa hay inox. Khi miếng mô đã được vùi vững chắc vào paraffin, làm rắn paraffin lại bằng cách đặt khuôn vào trong tủ lạnh, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn. Tiến hành cắt mô đúc trong khối paraffin gồm các bước sau: Đặt dao vào máy cắt, vận óc thật chặt. Độ lệch của lưỡi dao với mặt cắt của khối mẫu tạo thành 1 góc khoảng 15 – 300. Trước khi tiến hành cắt, phải điều chỉnh độ dày của lát cắt theo nghiên cứu mà mong muốn.
Dán lát cắt vào phiến kính: Sau khi cắt thì tiến hành dán lát cắt vào phiến kính
(slide): cho 1 giọt rất nhỏ dung dịch albumen (dung dịch albumen gồm lòng trắng trứng và glycerol với tỷ lệ 1:1 theo thể tích, trộn đều sau đó lọc qua giấy lọc thô hay bông gòn, thêm vào 1 ít tinh thể thymol để ngăn vi sinh vật phát triển (Kiernan, 1990)) lên phiến kính, dùng tay tay xoa đều để tạo thành một màng mỏng albumen trên phiến kính. Sau khi làm giản thẳng lát cắt trong chậu nước ấm, nhúng phiến
kính vào chậu nước ấm ngay bên dưới lát cắt. Cẩn thận đính một đầu của lát cắt vào phiến kính, điều chỉnh lát cắt dung hướng, từ từ rút phiến kính khỏi nước, lát cắt sẽ được dán chặt vào phiến kính. Phiến kính cần phải được làm sạch trước khi dán lát cắt vào. Sau khi dán lát cắt vào tiến hành làm khô phiến kính bằng cách sấy khô phiến kính 12 giở (1 đêm) trong tủ sấy ở nhiệt độ 370C để loại bỏ paraffin.
Nhuộm màu: Các bước nhuộm mẫu gồm các bước sau:
- Chuẩn bị dung dịch Mayer’s Hematoxylin: hòa tan 1 g tinh thể hematoxylin trong 750 mL nước cất. Thêm vào 0,2 g sodium iodate (NaIO3); 1 g acid citric và 50 g chloral hydrate. Thêm nước vào cho đủ 1 lít.
- Dung dịch chuẩn 1% eosin: 1 g eosin, 20 mL nước cất và 80 mL cồn (ethanol) 95%. Dung dịch nhuộm eosin được chuẩn bị như sau: 1 thể tích dung dịch chuẩn 1% eosin + 3 thể tích cồn 80%. Trước khi sử dụng thêm vào 0,5 ml acid acetic cho mỗi 100 mL dung dịch nhuộm eosin.
- Nhúng phiến mẫu vào xylen 2 – 3 phút - Chuyển sang xylen sạch 1 – 2 phút - Nhúng trong cồn tuyệt đối 1 – 2 phút
- Chuyển sang lần lượt các dung dịch cồn 95%, 70%, và 50%, 1 phút cho mỗi dung dịch.
- Rửa mẫu trong nước cất
- Nhúng phiến mẫu trong dung dịch Mayer’s Hematoxylin 15 phút - Rửa phiến mẫu dưới vòi nước 20 phút
- Nhúng phiến mẫu vào dung dịch nhuộm eosin từ 15 giây đến 2 phút tùy vào mức độ bắt màu của mẫu.
- Chuyển phiến mẫu sang 2 lần cồn 95%, mỗi lần 2 phút để rửa hết eosin thừa. Quan sát phiến mẫu bằng kính hiển vi, mẫu đạt yêu cầu khi nền mẫu trong và tế bào chất bắt màu từ hồng nhạt đến cam.
- Rửa phiến mẫu lại trong cồn 95%, sau đó chuyển phiến mẫu sang 2 lần cồn tuyệt đối, mỗi lần 2 phút. Làm trong mẫu bằng xylen 2 lần mỗi lần 2 phút. Sau khi nhuộm, dán phiến kính mỏng lên trên.
Hệ số thành thục phải được tính toán cho từng tháng và phải được tính toán riêng biệt cho từng giới. GSI được tính bằng công thức sau:
GSI(%) = (Wg/Wn) x 100 Trong đó:
GSI: Hệ số thành thục
Wg: Khối lượng tuyến sinh dục
Wn: Khối lượng thân cá bỏ nội quan (gam)
Phương pháp lấy tuyến sinh dục: Dùng kéo cắt mổ bụng của cá sao cho không cắt chạm đến tuyến sinh dục và nội quan của cá. Cận thận cắt tách nội quan của cá ra khỏi thân cá. Dùng kẹp tách tuyến sinh dục ra khỏi nội quan. Sau đó rữa sạch và làm khô tuyến sinh dục bằng giấy thấm. Tiến hành cân tuyến sinh dục sau khi được làm khô.
Theo dõi hệ số CF (nhân tố điều kiện) qua công thức sau:
CF = W/Lb Trong đó:
W: Khối lượng trung bình của cá (g) theo tháng L: Chiều dài trung bình cơ thể cá (cm) theo tháng b: Hệ số tăng trưởng của cá nghiên cứu
Phương pháp xác định sức sinh sản của cá
Phân tích sức sinh sản tuyệt đối theo công thức của Bagenad (1967): F = n.G/g
Trong đó:
F là sức sinh sản tuyệt đối
n là số lượng trứng giai đoạn IV trở lên trong mẫu đại diện G là khối lượng buồng trứng (gam)
g là khối lượng mẫu đại diện (gam)
Phương pháp đếm số trứng trong mẫu đại diện: Tất cả các trứng chín (giai đoạn IV trở lên) trong buồng trứng được tách riêng ra khỏi các trứng chưa chín và các mô
liên kết của buồng trứng. Làm khô bằng giấy thấm sau khi làm sạch, tiến hành đếm số trứng.
Phân tích sức sinh sản tương đối theo công thức của Hardisty (1964): FA = F/A
Trong đó:
FA là sức sinh sản tương đối F là sức sinh sản tuyệt đối W là khối lượng cá
3.3.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
● Xác định mối tương quan giữa chiều dài và khối lượng của 3 loài cá theo công thức (Trích dẫn của (Ricker, 1968))
W = aLb Trong đó:
W: Khối lượng của cá (g) a: Hằng số
L: Chiều dài cơ thể cá (cm) b: Hệ số tăng trưởng của cá
● Xác định mối tương quan giữa chiều dài thân cá và chiều dài đá tai qua phương trình của Harkonen (1986):
FL = c + d.OL Trong đó:
- FL là chiều dài thân cá - OL là chiều dài đá tai - c, d là tham số tăng trưởng
● Xác định mối tương quan giữa khối lượng thân cá và đá tai qua phương trình của Harkonen (1986):
FW = g.OLh Trong đó:
- FW là khối lượng thân cá - OL là chiều dài đá tai - g, h là tham số tăng trưởng
● Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu thu được đã được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel 2010. Xử lý các số liệu thu được dưới hình thức chạy các phương trình tương quan hồi qui, tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn.
CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Một số chỉ tiêu hình thái của 3 loài cá lóc
Căn cứ vào tài liệu của Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993) (xem Phụ lục 1), mẫu thu của các loài cá lóc thuộc giống Channa phân bố ở ĐBSCL đã được định danh, gồm có loài cá lóc đen, lóc bông và cá dầy (Hình 4.1, Hình 4.2 và Hình 4.3).
Hình 4.1: Hình dạng bên ngoài của cá lóc đen
Hình 4.2: Hình dạng bên ngoài của cá lóc bông
Kết quả đếm một số chỉ tiêu hình thái của 3 loài được ghi nhận và so sánh với kết quả định danh của Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993) (Bảng 4.1)
Bảng 4.1: So sánh một số chỉ tiêu hình thái của 3 loài cá lóc
Loài
Chỉ tiêu hình thái
Theo Trương Thủ Khoa và
Trần Thị Thu Hương (1993) Mẫu cá nghiên cứu Số mẫu
(con) Kết quả Số mẫu(con) Kết quả
Channa striata D 24 41 - 43 10 42 A 24 - 27 25 - 26 V 6 6 P 16 - 18 16 Channa micropeltes D 12 42 - 44 10 42 - 43 A 36 - 37 35 V 6 6 P 17 17 Channa lucius D 24 38 - 41 10 40 - 41 A 27 - 29 27 V 6 6 P 15 - 17 15 - 17
Qua bảng 4.1 cho thấy, mẫu cá của 3 loài cá lóc trong nghiên cứu này có các chỉ tiêu hình thái giống với nghiên cứu của Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993). Vì vậy, có thể kết luận số mẫu của các loài cá lóc thu được đã được định danh đúng theo phân loại loài.
4.2 Mối quan hệ tương quan giữa chiều dài và khối lượng thân cá của 3 loài cá lóc thuộc giống Channa lóc thuộc giống Channa
Mối tương quan giữa chiều dài và khối lượng thân cá của 3 loài cá lóc đã được xác định trong thời gian nghiên cứu.
Mối tương quan chiều dài và khối lượng thân cá của 3 loài cá lóc là cá lóc đen, cá lóc bông và cá dầy được xác định 3 phương trình tương quan hồi quy (Hình 4.4, Hình 4.5 và Hình 4.6). Mối tương quan này có quan hệ rất chặt chẽ với tuân theo quy luật đường cong tăng trưởng với hệ số R2 dao động từ 0,94 đến 0,97 và hệ số b dao động từ 2,4811 đến 3,0964. Đối với cá lóc đen và cá dầy, hệ số b đều nhỏ hơn 3, cho thấy số mẫu cá thu được là những cá thể trưởng thành nhiều hơn cá nhỏ. Theo quy luật đường cong tăng trưởng thì cá ở giai đoạn nhỏ phát triển chủ yếu về chiều dài, khi cá lớn dần lên thì chiều dài thân cá phát triển chậm lại và cá chủ yếu
phát triển về khối lượng. Vì vậy, theo phương trình tương quan hồi qui trên, số mẫu cá lóc đen và cá dầy thu được có sự phát triển về khối lượng hơn về chiều dài. Đối với cá lóc bông, hệ số b > 3, số mẫu cá thu được là cá chưa trưởng thành nên tốc độ tăng trưởng về chiều dài nhanh hơn so với khối lượng.
Hình 4.4: Tương quan chiều dài tổng và khối lượng thân cá lóc đen
Hình 4.5: Tương quan chiều dài tổng và khối lượng thân cá lóc bông
Qua các đường cong tăng trưởng thể hiện mối tương quan giữa chiều dài và khối lượng, cho thấy rằng ứng với một điểm thể hiện cho 1 cặp chiều dài – khối lượng thân cá thì các điểm này không hoàn toàn nằm trên đường cong lý thuyết mà có một số điểm nằm ngoài đường cong. Điều này là lẽ tự nhiên, một số cá thể không tuân theo quy luật của lý thuyết đường cong. Bởi vì thực tế, các yếu tố môi trường (nhiệt độ, ánh sang, dòng chảy…), thức ăn, mầm bệnh, di cư, tác động con người…ảnh
hưởng ít nhiều đến sự sinh trưởng và phát triển của cá. Mỗi cá thể có khả năng