Thí nghiệm gây cảm nhiễm - ỤC LỤC - tìm hiểu sự kh- 123docz.net

M ỤC LỤC

3.5.7 Thí nghiệm gây cảm nhiễm

Mục đích của thí nghiệm gây cảm nhiễm trong đề tài này là để kiểm chứng lại kết quả tái định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bằng bộ kit API 20E. Thí nghiệm được bố trí như sau:

- Bể composite (100L) và các dụng cụ được khử trùng bằng chlorine, xà phòng, rửa lại bằng nước sạch. Sau đó cho nước vào bể và lắp hệ thống sục khí liên tục vài ngày để loại hết chlorine.

- Cá tra có trọng lượng 50-60g/con, màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt được chọn và bố trí ngẫu nhiên 6con/bể vài ngày cho cá quen dần với môi trường nước. Vẫn cho ăn bình thường, tiến hành kiểm tra ký sinh trùng và vi sinh trước khi gây cảm nhiễm.

- Vi khuẩn sau khi phục hồi trên môi trường TSA, giữ trong tủ ấm 48 giờ ở 28C, sau đó chọn một khuẩn lạc nuôi tăng sinh trong môi trường nutrient broth 24 giờ, sau đó ly tâm 15 phút (4000 vòng/phút), rửa bằng nước muối sinh lý (0.85% NaCl), xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 650nm, xác định OD = 1(tương đương

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

109) (sau đó cho 10 µl dung dịch lên môi trường TSA đếm và xác định mật độ vi khuẩn), tiêm cho cá.

Hình 3.1: Các bước chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm

Vị trí tiêm là gốc vi ngực với liều lượng 0,2ml/cá. Sau khi tiêm theo dõi liên tục biểu hiện của cá trong 10 ngày, chọn những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt, tiến hành giải phẫu, phân lập lấy mẫu vi sinh thận, tỳ tạng và máu trên môi trường TSA. Theo dõi và ghi nhận sự phát triển của vi khuẩn trong tủ ấm ở 28 C trong 24 - 48 giờ. Nếu sau 10 ngày cá không có biểu hiện bất thường thì kết thúc thí nghiệm.

Phục hồi trên TSA (28C- 48h)

Tăng sinh trong NB

Ly tâm và rửa nước muối 3 lần

Xác định mật độ vi khuẩn Đo qua máy so màu (xác định

OD =1, ở bước sóng 680nm)

Đếm mật độ vi khuẩn trên môi trường TSA

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1 Phương pháp sinh hóa truyền thống

Kết quả quan sát, phân tích các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn nghiên cứu theo phương pháp sinh hóa truyền thống được trình bày ở Bảng 4.5

Hai chủng vi khuẩn phân lập trực tiếp trên cá bệnh (C1, C2), 4 chủng vi khuẩn phục hồi từ nguồn vi khuẩn của Khoa Thủy sản, trữ ở -80C (CAF255, CAF258, 2B1, 3B3) và chủng tham khảo (E223) sau khi phục hồi tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản gồm nhuộm gram, oxidase, catalase, O/F, tính di động. Sau đó kiểm tra các đặc điểm sinh hóa theo phương pháp của của Barrow và Feltham (1993), mỗi chỉ tiêu được lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất 2 lần lặp lại.

Bảng 4.5 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống

Chỉ tiêu CAF255 CAF258 2B1 3B3 C1 C2 E223 Chủng chuẩn của Hawke (1979) Di động + + + + + + + +

Gram - - - - - - - -

Hình dạng que que que que que que que que

Oxidase - - - - - - - - Catalase + + + + + + - + O/F + + + + + + + + Indole - - - - - - - - H2S - - - - - - - - Urea - - - - - - - - Arginine - - - - - - - - Lysine + + + + + + + + Ornithine + + + + + + + - VP - - - - - - - - Citrate - - - - - - - - ONPG - - - - - - - - Rhamnose - - - - - - - - Sorbitol - - - - - - - - Mannitol - - - - - - - - Arabinose - - - - - - - - Innositol - - - - - - - - Glucose + + + + + + + + Sucrose - - - - - - - -

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa bằng phương pháp truyền thống của 6 chủng vi khuẩn nghiên cứu giống với chủng tham khảo E223 ở hầu hết các chỉ tiêu, trừ chỉ tiêu catalase. Tất cả các chủng đều có dạng hình que, gram âm (hình 4.2), cho phản ứng oxidase âm tính, có khả năng lên men và oxi hóa đường glucose (hình 4.3), không có khả năng sinh khí H2S và không tạo sản phẩm indole (hình 4.4). Tuy nhiên tất cả các chủng đều có khả năng thủy phân lysine và ornithine (hình 4.5). Kết quả phân tích của đề tài cũng tương tự với kết quả phân tích các đặc tính sinh lý và sinh hóa của E. ictaluri trên cá nheo Mỹ (Hawke, 1979) ngoại trừ chỉ tiêu ornithin là dương tính.

Hình 4.2: Hình nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri

Hình 4.3 Khả năng lên men và oxi hóa đường glucose của vi khuẩn E. ictaluri

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.4: Kết quả âm tính với indole của vi khuẩn E. ictaluri

Hình 4.5: Khả năng thủy phân ornithin và lysine của vi khuẩn E. ictaluri

Theo báo cáo của Lương Trần Thục Đoan (2006) về việc định danh chủng vi khuẩn E. ictaluri mã số 224 phân lập trên cá tra, ngoài các đặc điểm trên còn có thêm phản ứng dương với citrate. Theo Dung và ctv (2004), E. ictaluri cho phản ứng oxidase âm tính và catalate dương tính. Ở đây chủng E223 cho phản ứng âm tính với catalate có thể vi khuẩn bị biến đổi đặc tính vì trữ lâu trong tủ âm -80C.

4.2 Kết quả test API

Song song với việc xác định các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn bằng phương pháp truyền thống, đề tài cũng tiến hành xác định các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn bằng bộ kít API 20E. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.6.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bảng 4.6: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn bằng bộ kít API 20E

Chỉ tiêu CAF255 CAF258 2B1 3B3 C1 C2 E223 Di động + + + + + + +

Gram - - - - - - -

Hình dạng que que que que que que que

Oxidase - - - - - - - Catalase + + + + + + - O/F + + + + + + + ONPG - - - - - - - ADH - - - - - - - LDC + + + + + + + ODC - - - - - - - CIT - - - - - - - H2S - - - - - - - UREA - - - - - - - IND - - - - - - - VP - - - - - - - GLU + + + + + + + MAN - - - - - - - INO - - - - - - - SOR - - - - - - - RHA - - - - - - - ARA - - - - - - - SAC - - - - - - -

Ghi chú: ONPG: beta galactosidase; ADH: arginine decarboxylase; LDC: lysine decarboxylase; ODC: ornithine decarboxylase; CIT: citrate; H2S: H2S production; UREA: ure; IND: indole; VP: phản ứng voges- proskauer; GLU: glucose; MAN: mannitol; INO: inositol; SOR: sorbitol; RHA: rhamnose; ARA: arabinose; SAC: sucrose.

Kết quả ở Bảng 4.6 cho thấy hầu hết các chỉ tiêu đều âm tính trừ glucose và lysine. Các chủng vi khuẩn trữ ở -80C (E223, 3B3, CAF258, CAF255, 2B1) và 2 chủng phân lập trực tiếp từ cá bệnh (C1, C2) đều cho kết quả giống nhau khi so với chủng tham khảo E223. Năm 2007, Lê Minh Đương thực hiện thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn chủng E223 trên cá tra, sau đó tái phân lập vi khuẩn từ máu, lớp nhớt trên da, mang, não, gan, thận, tỳ tạng và tim cho kết quả dương tính ở các chỉ tiêu glucose, lysine và citrate, các chỉ tiêu còn lại đều âm tính. Trong đề tài này chủng E223 không có khả năng sử dụng citrate, điều này có thể do vi khuẩn bị biến tính khi trữ quá lâu ở -80C

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Hình 4.6: Kết quả test API vi khuẩn E. ictaluri

Ghi chú: - âm tính + dương tính

1:Beta galactosidase (-); 2: Arginine (-); 3: Lysine (+); 4: Ornithine (-); 5: Citrate (-); 6: H2S (-); 7: Urea (-); 8: tryptophane (-); 9:indole (-);10: phản ứng Voges- Proskauer (-); 11: gelatin (-); 12: glucose (+); 13: Mannitol (-); 14: Inositol (-); 15: Sorbitol (-); 16: Rhamnose (-); 17: Sucrose (-); 18: Melibiose (-); 19: Amygdalin (-); 20: Arabinose(-)

4.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng PCR

PCR là công cụ giúp phát hiện nhanh và chính xác mầm bệnh vi sinh vật trên tôm, cá. Đề tài ứng dụng phương pháp PCR để phát hiện E. ictaluri nhằm kiểm tra tính chính xác của kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bằng bộ kít API 20E. Kết quả PCR được trình bày ở hình 4.7

Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng E. ictaluri Giếng M: thang đo DNA (1 kb plus Invitrogen); Giếng 1: đối chứng âm (nước); Giếng 2: chủng 223; Giếng 3: chủng 258; Giếng 4: chủng 3B3; Giếng 5: chủng C1;Giếng 6: chủng C2

Từ kết quả ở hình 4.6 cho thấy cả 5 mẫu đều hiện vạch tại vị trí 407 pb chứng tỏ có sự hiện diện của E. ictaluri, trên tất cả các mẫu đều không có sản phẩm

407bp 1650bp 850bp 650b p 100bp 200b p

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

phụ, tuy nhiên ở giếng số 3 và số 5 mẫu hiện vạch không rõ như các giếng còn lại có thể là do hàm lượng ADN chiết tách không đủ. Nồng độ của mạch khuôn và đoạn mồi sử dụng trong phản ứng này là 20ng và 0.4 µM, điều này cũng được ghi nhận bởi Panangala và ctv (2007) ông cho rằng điều kiện tối ưu nhất cho phản ứng PCR này là nồng độ của mạch khuôn lần lượt là 60, 30 và 20ng; nồng độ mồi trong khoảng 0.2 đến 0.8 µM, vì quy trình chạy 1 lần ra kết quả nên không cần phải tối ưu thêm nữa. Tuy nhiên nếu có điều kiện nên tiến hành thử giảm các thành phần để có thể tiết kiệm chi phí mà vẫn mang lại kết quả tốt nhất. Do điều kiện không cho phép nên chưa tiến hành chạy 2 mẫu CAF255 và 2B1.

4.4 Kết quả gây cảm nhiễm và tái định danh vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được gây cảm nhiễm trên cá khỏe để xác định khả năng gây bệnh mủ gan, sau đó tái phân lập và tái định danh vi khuẩn từ thận, tỳ tạng và máu. Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn gây bệnh trước và sau khi gây cảm nhiễm được so sánh nhằm xác định tính đồng nhất của phương pháp định danh.

5 dòng vi khuẩn được chọn ngẫu nhiên cho thí nghiệm gây cảm nhiễm là E223, 3B3, CAF258, C1 và C2 với các mật độ lần lượt 1.3x107, 0.7x107, 0.2x107, 1x107 và 1.5x107 CFU/ml. Cá được thuần hóa cho quen với môi trường nước thí nghiệm, sau đó được kiểm tra ký sinh trùng và phân lập vi sinh, trước khi tiến hành gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với liều lượng 0.2ml/cá. Sau 2 ngày theo dõi liên tục, cá ở các bể tiêm vi khuẩn chủng CAF258, C1 và C2 bắt đầu có biểu hiện bệnh lý như bơi lội lờ đờ, kém linh hoạt. Giải phẫu quan sát nội quan và lấy mẫu vi sinh ở thận, tỳ tạng và máu. Kết quả cho thấy bể tiêm vi khuẩn chủng CAF258 có tỷ lệ cá chết là 4/6 con, bể C1 có tỷ lệ cá chết là 3/6 và bể C2 có tỉ lệ cá chết là 4/6. Thận cá có những đốm trắng nhỏ li ti (hình 4.8) nhưng tỳ tạng thì không biểu hiện, bóng hơi cá rất mềm. Sự xuất hiện vi khuẩn đầu tiên ở thận đã được Ferguson và ctv

(2001) ghi nhận khi tìm hiểu về bệnh mủ gan trên cá tra ở nuôi ở ĐBSCL. Tác giả cho biết đặc trưng của bệnh mủ gan là những đốm trắng kích thước 1- 3mm xuất hiện trên gan, thận và tỳ tạng nhưng ở giai đoạn mới bộc phát thì đốm trắng chỉ có ở thận và tỳ tạng. Điều này cũng được trình bày trong báo cáo kết quả gây cảm nhiễm chủng E. ictaluri 223 của Tiết Ngọc Trân (2006) khi gây cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm sử dụng nồng độ 0,9x108 CFU/ml kết quả vi khuẩn xuất hiện ở hầu hết các cơ quan phân lập nhưng tỷ lệ cao nhất là ở thận trong mọi thời điểm thu mẫu.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hầu hết bên ngoài cơ thể cá vẫn bình thường, một số ít xuất huyết ở các gốc vây (hình 4.9), tiến hành lấy mẫu bệnh phẩm phân lập vi khuẩn ở thận, tỳ tạng và máu, cấy lên môi trường TSA, sau đó ủ ở 28C trong vòng 24 - 48 giờ thì thấy xuất hiện các khuẩn lạc nhỏ, tròn, trắng đục, không nhân. Tuy nhiên có một số cá chết mà không thấy dấu hiệu lâm sàng đặc trưng nêu trên.

Hình 4.8: Thận cá tra gây cảm nhiễm dòng vi khuẩn CAF258

Đốm trắng ở thận ( )

Hình 4.9: Dấu hiệu bên ngoài của cá tra gây cảm nhiễm dòng E. ictaluri

Xuất huyết ở các gốc vây ( )

Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa được thực hiện với vi khuẩn được tái phân lập gồm: nhuộm Gram, phản ứng O/F, oxidase, catalase, tính di động. Kết quả tái xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa bằng phương pháp sinh hóa truyền thống được trình bày ở Bảng 4.7. Kết quả tái xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa bằng bộ kít API 20E được trình bày ở Bảng 4.8. Các chủng vi khuẩn tái phân lập từ cá tra thí nghiệm đều có hình que, Gram âm, di động

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

yếu, phản ứng oxidase âm tính, phản ứng catalase, tất cả đều có khả năng lên men O/F trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí qua hai phương pháp sinh hóa và cho kết quả PCR giống nhau (hiện vạch 407 bp).

Bảng 4.7: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp

sinh hóa truyền thống

CAF258 C1 C2

Chỉ tiêu

TCN SCN TCN SCN TCN SCN Di động + + + + + +

Gram - - - - - -

Hình dạng que que que que que que Oxidase - - - - - - Catalase + + + + + + O/F + + + + + + Indole - - - - - - H2S - - - - - - Urea - - - - - - Arginine - - - - - - Lysine + + + + + + Ornithine + + + + + + VP - - - - - - Citrate - - - - - - ONPG - - - - - - Rhamnose - - - - - - Sorbitol - - - - - - Mannitol - - - - - - Arabinose - - - - - - Innositol - - - - - - Glucose + + + + + + Sucrose - - - - - - Ghi chú:

TCN: trước khi gây cảm nhiễm SCN: sau khi gây cảm nhiễm

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bảng 4.8: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng bộ kít API 20E

CAF258 C1 C2

Chỉ tiêu

TCN SCN TCN SCN TCN SCN

Di động + + + + + +

Gram - - - - - -

Hình dạng que que que que que que Oxidase - - - - - - Catalase + + + + + + O/F + + + + + + ONPG - - - - - - ADH - - - - - - LDC + + + + + + ODC - - - - - - CIT - - - - - - H2S - - - - - - UREA - - - - - - IND - - - - - - VP - - - - - - GLU + + + + + + MAN - - - - - - INO - - - - - - SOR - - - - - - RHA - - - - - - ARA - - - - - - SAC - - - - - -

Nhìn chung tất cả các chỉ tiêu ở 3 chủng vi khuẩn trước và sau khi gây cảm nhiễm ( CAF258, C1, C2) đều có kết quả giống nhau ở cả 3 phương pháp sinh hóa truyền thống, test API và chạy PCR.

Trong khi đó, các bể tiêm vi khuẩn chủng E223 và 3B3 sau 10 ngày theo dõi không thấy xuất hiện dấu hiệu bất thường, một số cá thí nghiệm có hiện tượng xuất huyết ở các vây, tuy nhiên khi lấy mẫu vi sinh trên máu, thận và tỳ tạng cấy trên môi trường TSA sau 48 giờ ở 28C không thấy sự hiện diện của vi khuẩn ở bất kỳ cơ quan nào.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

4.5 Thảo luận

Đề tài được thực hiện với nội dung tìm hiểu những chỉ tiêu sinh hóa khác nhau khi sử dụng phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kít API 20E. Nhìn chung hầu hết các chỉ tiêu đều giống nhau khi sử dụng hai phương pháp này. Tuy nhiên, vẫn có sự sai khác ở một số chỉ tiêu là ornithine dương tính đối với phương pháp sinh hóa truyền thống và âm tính đối với kít API 20E. Theo ghi nhận từ nhiều tài liệu thì chỉ tiêu ornithine cũng có nhiều biến đổi. Cụ thể năm 1986, Waltmam và ctv tiến hành kiểm tra 119 dòng E. ictaluri thì có 100 dòng cho phản ứng dương tính với ornithine còn lại 19 dòng cho phản