M ỤC LỤC
4.4 Kết quả gây cảm nhiễm và tái định danh vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được gây cảm nhiễm trên cá khỏe để xác định khả năng gây bệnh mủ gan, sau đó tái phân lập và tái định danh vi khuẩn từ thận, tỳ tạng và máu. Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn gây bệnh trước và sau khi gây cảm nhiễm được so sánh nhằm xác định tính đồng nhất của phương pháp định danh.
5 dòng vi khuẩn được chọn ngẫu nhiên cho thí nghiệm gây cảm nhiễm là E223, 3B3, CAF258, C1 và C2 với các mật độ lần lượt 1.3x107, 0.7x107, 0.2x107, 1x107 và 1.5x107 CFU/ml. Cá được thuần hóa cho quen với môi trường nước thí nghiệm, sau đó được kiểm tra ký sinh trùng và phân lập vi sinh, trước khi tiến hành gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với liều lượng 0.2ml/cá. Sau 2 ngày theo dõi liên tục, cá ở các bể tiêm vi khuẩn chủng CAF258, C1 và C2 bắt đầu có biểu hiện bệnh lý như bơi lội lờ đờ, kém linh hoạt. Giải phẫu quan sát nội quan và lấy mẫu vi sinh ở thận, tỳ tạng và máu. Kết quả cho thấy bể tiêm vi khuẩn chủng CAF258 có tỷ lệ cá chết là 4/6 con, bể C1 có tỷ lệ cá chết là 3/6 và bể C2 có tỉ lệ cá chết là 4/6. Thận cá có những đốm trắng nhỏ li ti (hình 4.8) nhưng tỳ tạng thì không biểu hiện, bóng hơi cá rất mềm. Sự xuất hiện vi khuẩn đầu tiên ở thận đã được Ferguson và ctv
(2001) ghi nhận khi tìm hiểu về bệnh mủ gan trên cá tra ở nuôi ở ĐBSCL. Tác giả cho biết đặc trưng của bệnh mủ gan là những đốm trắng kích thước 1- 3mm xuất hiện trên gan, thận và tỳ tạng nhưng ở giai đoạn mới bộc phát thì đốm trắng chỉ có ở thận và tỳ tạng. Điều này cũng được trình bày trong báo cáo kết quả gây cảm nhiễm chủng E. ictaluri 223 của Tiết Ngọc Trân (2006) khi gây cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm sử dụng nồng độ 0,9x108 CFU/ml kết quả vi khuẩn xuất hiện ở hầu hết các cơ quan phân lập nhưng tỷ lệ cao nhất là ở thận trong mọi thời điểm thu mẫu.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Hầu hết bên ngoài cơ thể cá vẫn bình thường, một số ít xuất huyết ở các gốc vây (hình 4.9), tiến hành lấy mẫu bệnh phẩm phân lập vi khuẩn ở thận, tỳ tạng và máu, cấy lên môi trường TSA, sau đó ủ ở 28C trong vòng 24 - 48 giờ thì thấy xuất hiện các khuẩn lạc nhỏ, tròn, trắng đục, không nhân. Tuy nhiên có một số cá chết mà không thấy dấu hiệu lâm sàng đặc trưng nêu trên.
Hình 4.8: Thận cá tra gây cảm nhiễm dòng vi khuẩn CAF258
Đốm trắng ở thận ( )
Hình 4.9: Dấu hiệu bên ngoài của cá tra gây cảm nhiễm dòng E. ictaluri
Xuất huyết ở các gốc vây ( )
Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa được thực hiện với vi khuẩn được tái phân lập gồm: nhuộm Gram, phản ứng O/F, oxidase, catalase, tính di động. Kết quả tái xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa bằng phương pháp sinh hóa truyền thống được trình bày ở Bảng 4.7. Kết quả tái xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa bằng bộ kít API 20E được trình bày ở Bảng 4.8. Các chủng vi khuẩn tái phân lập từ cá tra thí nghiệm đều có hình que, Gram âm, di động
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
yếu, phản ứng oxidase âm tính, phản ứng catalase, tất cả đều có khả năng lên men O/F trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí qua hai phương pháp sinh hóa và cho kết quả PCR giống nhau (hiện vạch 407 bp).
Bảng 4.7: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp
sinh hóa truyền thống
CAF258 C1 C2
Chỉ tiêu
TCN SCN TCN SCN TCN SCN Di động + + + + + +
Gram - - - - - -
Hình dạng que que que que que que Oxidase - - - - - - Catalase + + + + + + O/F + + + + + + Indole - - - - - - H2S - - - - - - Urea - - - - - - Arginine - - - - - - Lysine + + + + + + Ornithine + + + + + + VP - - - - - - Citrate - - - - - - ONPG - - - - - - Rhamnose - - - - - - Sorbitol - - - - - - Mannitol - - - - - - Arabinose - - - - - - Innositol - - - - - - Glucose + + + + + + Sucrose - - - - - - Ghi chú:
TCN: trước khi gây cảm nhiễm SCN: sau khi gây cảm nhiễm
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Bảng 4.8: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng bộ kít API 20E
CAF258 C1 C2
Chỉ tiêu
TCN SCN TCN SCN TCN SCN
Di động + + + + + +
Gram - - - - - -
Hình dạng que que que que que que Oxidase - - - - - - Catalase + + + + + + O/F + + + + + + ONPG - - - - - - ADH - - - - - - LDC + + + + + + ODC - - - - - - CIT - - - - - - H2S - - - - - - UREA - - - - - - IND - - - - - - VP - - - - - - GLU + + + + + + MAN - - - - - - INO - - - - - - SOR - - - - - - RHA - - - - - - ARA - - - - - - SAC - - - - - -
Ghi chú: ONPG: beta galactosidase; ADH: arginine decarboxylase; LDC: lysine decarboxylase; ODC: ornithine decarboxylase; CIT: citrate; H2S: H2S production; UREA: ure; IND: indole; VP: phản ứng voges- proskauer; GLU: glucose; MAN: mannitol; INO: inositol; SOR: sorbitol; RHA: rhamnose; ARA: arabinose; SAC: sucrose TCN: trước khi gây cảm nhiễm SCN: sau khi gây cảm nhiễm
Nhìn chung tất cả các chỉ tiêu ở 3 chủng vi khuẩn trước và sau khi gây cảm nhiễm ( CAF258, C1, C2) đều có kết quả giống nhau ở cả 3 phương pháp sinh hóa truyền thống, test API và chạy PCR.
Trong khi đó, các bể tiêm vi khuẩn chủng E223 và 3B3 sau 10 ngày theo dõi không thấy xuất hiện dấu hiệu bất thường, một số cá thí nghiệm có hiện tượng xuất huyết ở các vây, tuy nhiên khi lấy mẫu vi sinh trên máu, thận và tỳ tạng cấy trên môi trường TSA sau 48 giờ ở 28C không thấy sự hiện diện của vi khuẩn ở bất kỳ cơ quan nào.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu