3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Nội dung nghiên cứu
- Điều tra tình hình nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV trên khoai tây tại thành phố Đà Lạt thông qua việc thực hiện phản ứng ELISA trên các mẫu thu thập tại các phƣờng.
- Kiểm tra các mẫu có phản ứng ELISA dƣơng tính với virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR.
- Giải trình tự đoạn DNA có đƣợc từ sản phẩm RT-PCR để khẳng định nguồn gốc của đoạn gen đó, đánh giá mức độ tƣơng đồng với gen của virus PLRV có trên ngân hàng gen.
3.3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu
Công tác điều tra tình hình bệnh virus trên khoai tây ở thành phố Đà Lạt đƣợc tiến hành nhƣ sau
- Liên hệ Phòng Nông nghiệp, Chi cục Bảo vệ Thực vật và Trạm Khuyến nông thành phố để điều tra tình hình phân bố diện tích, chủng loại giống, vùng tập trung và các yếu tố liên quan đến bệnh virus trên khoai tây từ đó xác định địa bàn tiêu biểu cần điều tra.
- Điều tra tại các hộ nông dân có trồng khoai tây theo mẫu điều tra đã chuẩn bị sẵn gồm các chỉ tiêu nhƣ: Đặc điểm vƣờn trồng, chủng loại giống, kỹ thuật canh tác, tình hình sâu bệnh.
Khâu lấy mẫu đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Tùy theo diện tích có thể lấy từ 5 - 10 mẫu /vƣờn theo đƣờng chéo. Mẫu là toàn bộ thân cây, đƣợc cho vào bao nylon có ghi nhãn cẩn thận về thời gian, địa điểm, chủ vƣờn, loại cây, tuổi cây, triệu chứng, điều kiện canh tác. Mẫu đƣợc cho vào thùng xốp và đƣợc giữ lạnh cho đến khi kết thúc đợt lấy mẫu.
- Mẫu đƣợc đem về phòng thí nghiệm trong điều kiện đƣợc giữ lạnh và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân tích.
Bảng 3.1 Số mẫu thu thập từ 5 phƣờng thuộc tp.Đà Lạt STT Địa điểm
Lấy mẫu
Tổng số mẫu
Giống Tuổi cây Thế hệ
06 07 1T 1.5T 2T 2.5T 3T F1 F2 F3 1 2 3 4 5 Phƣờng 5 Phƣờng 8 Phƣờng 9 Phƣờng 11 Phƣờng 12 32 24 54 18 23 22 0 0 0 0 10 24 54 18 23 5 0 15 0 0 6 0 10 8 0 6 0 12 0 13 10 0 0 0 0 5 24 17 10 10 16 11 32 0 11 0 13 22 10 12 16 0 0 8 0 Tổng cộng 150 22 128 20 24 31 10 66 70 57 24 T: tháng
3.3.3 Phƣơng pháp phát hiện PVX, PVY và PLRV
3.3.3.1 Phát hiện PVX, PVY và PLRV bằng kĩ thuật ELISA
Sử dụng phƣơng pháp dDAS-ELISA (direct Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) theo sự hƣớng dẫn thực hiện của bộ kit và đƣợc tiến hành qua 2 giai đoạn. Giai đoạn 1: Thực hiện 1 lần ly trích virus để kiểm tra cả virus PVX, PVY và PLRV. Giai đoạn 2: Thực hiện phản ứng ELISA.
Giai đoạn 1: Ly trích mẫu
Trƣớc tiên ta phải dùng nƣớc cất vô trùng (chuẩn bị trƣớc) để pha dịch ly trích mẫu từ 20X xuống còn 1X. Dịch trích đƣợc pha loãng để dùng ly trích cả PVX, PVY và PLRV.
Tổng số mẫu cần nghiền là 135 mẫu
Các mẫu đƣợc lấy ra từ tủ lạnh -20oC, cắt lấy phần thân, chồi non hoặc gân chính của lá (có cả phiến lá) và cân khoảng 0,5 gam cho vào cối.
Hút 2,5 ml dung dịch trích mẫu, dùng chày nghiền mẫu cho đến khi các thành phần đều nát vụn.
Đổ dịch mẫu vừa nghiền xong vào eppendoff 1,5 ml. Sau đó ta đem li tâm với tốc độ 5000 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC. Đem mẫu cất vào tủ mát (2 - 8oC) để dùng sau.
Giai đoạn 2: Thực hiện phản ứng ELISA Bƣớc 1
Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí mẫu. Theo chỉ dẫn của kit, ta bỏ hàng A và H; bỏ cột 12. Do đó đĩa ELISA 96 giếng chỉ kiểm tra đƣợc 27 mẫu, mỗi mẫu đƣợc cho vào 2 giếng. Mỗi đĩa đều đƣợc ghi số thứ tự từ 1 đến 5 và tên của virus đang thực hiện chẩn đoán.
Sơ đồ bố trí trên đĩa ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H
BF: Buffer 1; 2…; 27: Số thứ tự của mẫu PC (Positive control) : Đối chứng dƣơng
NC (Negative control): Đối chứng âm Substrate: Cơ chất
Bƣớc 2
Pha loãng kháng thể (kháng thể 1) bằng dung dịch đệm (tỷ lệ pha theo bảng dƣới đây).
Bảng 3.2 Tỷ lệ pha loãng kháng thể Hóa chất PVX PVY PLRV Dung dịch đệm Kháng thể 10ml 100µl 10ml 100µl 10ml 20µl
Dùng pipet 8 đầu hút nƣớc cất vào cột số 1. Cũng với pipet trên ta hút kháng thể cho vào các giếng từ cột số 2 đến số 11 (100 µl / giếng). Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa và đem ủ ở 37oC trong 2 giờ. Sau đó rửa 3 lần với PBS-Tween bằng máy rửa đĩa ELISA.
Bƣớc 3
- Trƣớc tiên ta phải hòa tan đối chứng dƣơng và đối chứng âm với cùng một thể tích nƣớc là 1ml
- Dùng pipet 8 đầu hút nƣớc cất (100 µl / giếng) cho vào cột số 1 (substrate). - Cho 100 µl đối chứng dƣơng vào 2 ô PC (Positive control).
- Cho 100 µl đối chứng âm vào 2 ô NC (Negative control).
- Cho dịch trích mẫu vào (100 µl / giếng). Tổng cộng 135 mẫu sẽ đƣợc cho vào 5 đĩa, mỗi đĩa 27 mẫu, mỗi mẫu 2 giếng theo bố trí ở bảng 3.1.
- Dùng keo trong dán kín mặt đĩa, đem ủ qua đêm trong tủ mát 2 - 8oC. Sau đó đem rửa 3 lần với PBS - Tween.
Trong bƣớc này cần chú ý các điểm sau đây.
- Cần ghi lại chính xác kí hiệu của mẫu tƣơng ứng với số thứ tự của mẫu trên đĩa. - Thao tác cẩn thận tránh hiện tƣợng nhiễm chéo.
Bƣớc 4
- Pha loãng kháng thể gắn enzyme (Conjugate antibodies) (kháng thể 2) trong dung dịch đệm theo tỉ lệ cho trong bảng dƣới đây. Kháng thể này đƣợc pha trong đĩa petri.
Bảng 3.3 Tỷ lệ pha loãng kháng thể gắn enzyme
Hóa chất PVX PVY PLRV Dung dịch đệm 1X Kháng thể gắn enzyme 10ml 100µl 10ml 100µl 10ml 20µl
- Dùng pipet 8 đầu hút nƣớc cất (100 µl / giếng) cho vào cột số 1 (Substrate). - Dùng pipet 8 đầu hút kháng thể đã pha loãng vào mỗi giếng từ cột số 2 đến số 11 (100 µl / giếng). Dùng keo trong dán kín mặt đĩa và đem ủ 37oC trong 2 giờ. Sau đó rữa 3 lần với PBS - Tween.
Bƣớc 5
Chuẩn bị cơ chất tạo màu: p-NPP (p - nitrophenyl phosphate) có trong kit ở dạng viên rắn. Ta phải xác định lƣợng cơ chất cần thiết cho sự hiển thị màu. Sau đó đem những viên này đi nghiền nát ra và cho vào dung dịch đệm với tỷ lệ cho dƣới đây. Dùng một hủ nhựa nhỏ để hòa tan chất tạo màu và sau đó đổ ra đĩa petri. Dùng pipet 8 đầu, hút 100 µl p-NPP vào mỗi giếng từ cột số 1 đến số 11. Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa và đem ủ 37oC và đọc kết quả.
Bảng 3.4. Tỷ lệ pha loãng cơ chất tạo màu
Hóa chất PVX PVY PLRV Dung dịch đệm 1X p - NPP (2 viên 5 mg) 10 ml 5 mg 10 ml 5 mg 10 ml 5 mg Bƣớc 6
Đọc kết quả bằng máy đọc của hãng Bio - Rad với bƣớc sóng 405 nm tại các thời điểm 30 phút, 1giờ sau khi ủ với chất tạo màu.
OD mẫu = OD đọc (thô) – OD trung bình của các giếng có cơ chất (Substrate). OD mẫu so với ngƣỡng (ngƣỡng = hai lần trung bình OD của đối chứng âm). POS: Kết quả dƣơng tính-nhiễm bệnh khi OD của mẫu vƣợt quá ngƣỡng. NEG: Kết quả âm tính – Không nhiễm bệnh khi OD của mẫu dƣới ngƣỡng.
Bên cạnh đó kết quả cũng có thể đƣợc đánh giá bằng mắt thƣờng thông qua sự đổi màu của các giếng:
- Nếu màu đậm tƣơng đƣơng hoặc cao hơn so với đối chứng dƣơng: Đánh giá nhiễm bệnh
- Nếu giếng không màu tƣơng đƣơng hoặc thấp hơn so với đối chứng âm: Đánh giá không nhiễm bệnh.
3.3.3.2 Phát hiện virus PLRV bằng phƣơng pháp RT-PCR
Các mẫu sau khi đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA sẽ đƣợc chọn ra để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR. Trong đề tài này chúng tôi chỉ thực hiện phản ứng RT- PCR trên đối tƣợng virus PLRV.
Tiêu chuẩn chọn mẫu để thực hiện RT-PCR - Dƣơng tính.
- Triệu chứng đƣợc quan sát phải đặc trƣng và biểu hiện ra ngoài. - Mẫu đƣợc bảo quản tốt (còn tƣơi).
Dựa trên những tiêu chí trên, ta chọn ra đƣợc 5 mẫu đại diện cho 5 phƣờng tại thành phố Đà Lạt - Phƣờng 5: Mẫu 148 - Phƣờng 8: Mẫu 97 - Phƣờng 9: Mẫu 45 - Phƣờng 11: Mẫu 92 - Phƣờng 12: Mẫu 10
Kỹ thuật RT-PCR đƣợc sử dụng là 2 bƣớc (two steps), tức là gồm giai đoạn tổng hợp cDNA (Reverse) và giai đoạn khuếch đại cDNA (PCR). Virus PLRV đƣợc phát hiện dựa trên một đoạn gen có kích thƣớc 336 bp, mã hóa cho phân tử protein vỏ. Quá trình thực hiện phải qua 2 giai đoạn: Ly trích RNA, tổng hợp và khuếch đại cDNA nhờ phản ứng RT-PCR.
Giai đoạn 1: Ly trích RNA
Quá trình ly trích RNA đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit ly trích RNA (The Aurum total RNA kit). Tuy nhiên để thực hiện đúng yêu cầu ta phải chuẩn bị trƣớc một số dụng cụ và hóa chất sau:
- Nƣớc phải đƣợc xử lý với DEPC để khử RNase. Cối chày phải đƣợc hấp khử trùng sau khi đã đƣợc tráng nƣớc chƣa khử DEPC.
- Đầu tip, eppendoff phải đƣợc xử lý sao cho đảm bảo vô trùng và không còn sự hiện diện của enzyme phân hủy RNA. Tất cả phải đƣợc chuẩn bị trƣớc khi ly trích một ngày.
*Quy trình ly trích
Thực hiện theo chỉ dẫn của bộ kit. Lƣu ý, một số hóa chất không đƣợc cung cấp cùng với kit nên ta phải chuẩn bị riêng. Ta phải chuẩn bị
- Polyvinyl pyrolidone (PVP) 2% -Tris base pH = 7,5
- Ethanol 70%, 100% - β - mercaptoethanol
- Pha DNase I từ dạng bột thành dạng lỏng - Pha low stringency
Các bƣớc tiến hành ly trích RNA
1. Cân khoảng 80 mg mẫu lá, cắt ra từng miếng nhỏ (< 5 mm). Nghiền mịn trong nitơ lỏng. Chú ý không để cho mẫu bị chảy nƣớc trong lúc nghiền.
2. Cho 60 mg mẫu đã nghiền vào tube 2 ml có nắp đậy (có sẵn trong kit). Cho 14 µl PVP 2% vào mỗi 700 µl dịch ly trích mẫu (lysis solution).
3. Cho 700 µl dịch ly trích mẫu (lysis solution) đã bỗ sung PVP 2% vào tube chứa mẫu và trộn đều bằng pipet từ 12 - 15 lần.
4. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 3 phút ở 4oC. Sau đó hút dịch nổi sang tube 2 ml (có trong kit).
5. Cho 700 µl ethanol 70% vào tube chứa dịch nổi, trộn đều bằng pipet cho đến khi dịch không còn phân lớp.
6. Cho dịch hòa tan RNA (elution solution) vào bể điều nhiệt ở 70o
C. Cho RNA binding column vào tube 2 ml không có nắp đậy.
7. Hút 700 µl dịch mẫu cho vào RNA binding column. Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới ra khỏi tube (thực hiện nhiều lần cho đến khi hết mẫu thì thôi).
8. Cho 80 µl ethanol 100% vào 20 ml dịch rửa nhẹ (low stringency).
9. Cho 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency) đã bổ sung ethanol 100% vào RNA binding column. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới.
10. Pha DNase I với 250 µl Tris base pH = 7,5, trộn đều.
11. Pha 5 µl DNase I với 75 µl dịch pha loãng DNase (DNase delution solution) cho một mẫu ly trích trong tube 1,5 ml.
Cho 80 µl dung dịch DNase vào RNA binding column. Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới.
12. Thêm 700 µl dịch rửa mạnh (high stringency wash solution) vào RNA binding column.
Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC Loại phần dịch bên dƣới
13. Thêm 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency wash solution) vào RNA binding column.
Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC Loại phần dịch bên dƣới.
Ly tâm tiếp 60 giây với tốc độ 12000 vòng ở 4oC để loại hoàn toàn dịch rửa. 14. Cho RNA binding column vào tube 1,5 ml (có trong kit) có nắp đậy.
Cho 80 µl dịch hòa tan RNA (elution solution) đã ủ ở 70oC vào RNA binding column, giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 giây.
Ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở 4oC để thu RNA tổng số. RNA đem ủ ở 4oC để dùng sau.
*Những lƣu ý khi ly trích
- Phải có khu vực làm việc riêng
- Trong quá trình ly trích, phải thao tác càng nhanh càng tốt - Thay bao tay thƣờng xuyên khi thấy cần thiết
Giai đoạn 2: Tổng hợp cDNA
Mẫu RNA đƣợc ly trích ở trên sẽ đƣợc dùng để chạy RT-PCR. Mục đích để khuếch đại 1 đoạn gen mã hóa cho phân tử protein vỏ của virus PLRV. Quy trình này gồm hai bƣớc (two steps).
Bƣớc 1: Tổng hợp cDNA
Tổng hợp cDNA theo hƣớng dẫn của bộ kit tổng hợp cDNA (iScript cDNA kit). Thành phần các loại hóa chất cho 1 phản ứng tổng hợp cDNA đƣợc cho theo bảng dƣới đây. Đối với lƣợng RNA cho vào ta thay đổi thể tích từ 2 - 5 µl trong một phản ứng.
Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA
Thành phần Thể tích
5X iScript reaction Mix Enzyme RNA Nƣớc 4 µl 1 µl 5 µl (1 - 5 µg) Cho vào để đủ 20 µl Tổng thể tích 20 µl
Chu kỳ nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA 25oC trong 5 phút
42oC trong 30 phút 85oC trong 5 phút Giữ ở 4oC
cDNA đƣợc tổng hợp (20 µl) có thể đem sử dụng ngay trong phản ứng PCR hoặc cất ở 4oC để chạy PCR sau.
Bƣớc 2: Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại cDNA
Bƣớc này ta không sử dụng kit mà thực hiện theo nghiên cứu của Fattouma DJILANI và Hatem FAKHFAKH ở đại học Tuynidi vào năm 2002.
Thành phần hóa chất cho một phản ứng 25 µl đƣợc cho theo bảng dƣới đây
Bảng 3.6 Thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA
Thành phần Nồng độ cuối
Dung dịch đệm PCR 10X MgCl2
Hỗn hợp dNTP (dNTP Mix) Mồi xuôi (sens primer) Mồi ngƣợc (antisens primer)
iTaq polymerase cDNA Nƣớc 1X 1 mM 0,2 mM 0,3 µM 0,3 µM 1 U/µl 2,5 - 5 µl Cho vào để đủ 25 µl Tổng thể tích 25 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR - 94oC trong 5 phút
- 94oC trong 1 phút
- 50oC trong 1 phút 35 chu kỳ - 72oC trong 1 phút
- 72oC trong 10 phút
Lƣợng cDNA cho vào mỗi phản ứng thay đổi từ 2,5 – 5 µl. Sau khi thực hiện phản ứng PCR, ta sẽ thu đƣợc 25 µl sản phẩm (cDNA sợi đôi). Ta có thể thực hiện điện di ngay để xem kết quả hoặc cũng có thể trữ ở -20oC để chạy điện di sau.
Để kiểm tra sản phẩm RT-PCR có phải là đoạn gen mong muốn không ta thực hiện điện di trên gel agarose.
Nồng độ gel: 1,5% Hiệu điện thế: 50 V
Cƣờng độ dòng điện: 250 mA
Thời gian điện di: 45 phút (có thể canh vạch loading dye) Tỷ lệ mẫu : loading dye là 4 µl : 2 µl
Nhuộm ethidium bromide trong 20 phút Đọc kết quả trên máy chiếu tia UV.
3.3.3.3 Giải trình tự trực tiếp đoạn gen của virus PLRV
Sau khi kiểm tra kết quả bằng điện di nếu thấy có đoạn gen mong muốn (kích thƣớc 336 bp), chúng tôi thực hiện tiếp bƣớc giải trình tự nhằm xác định chính xác đoạn gen của PLRV và khẳng định có sản phẩm phụ hay không.
Việc giải trình tự tiến hành trực tiếp từ sản phẩm RT-PCR, theo nguyên tắc của Sanger. Phƣơng pháp này sử dụng một primer (hoặc sense hoặc antisense) cho một lần giải trình tự. Trong đề tài này, ta sẽ tiến hành giải trình tự bằng cả primer sense lẫn antisense.
Bƣớc 1: Chạy cycle sequencing
- Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng Bigdye 2,5X 2 µl Bigdye buffer 5X 1 µl Sản phẩm PCR 3 - 10 ng Primer 3,2 pmol Nƣớc cho vào để đƣợc thể tích 10 µl
Bigdye 2,5X bao gồm: enzyme kéo dài mẫu, buffer, dNTP và ddNTP. -Mỗi phản ứng chỉ sử dụng hoặc là primer xuôi hoặc là primer ngƣợc