3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3.3Giải trình tự trực tiếp đoạn gen của virus PLRV
Sau khi kiểm tra kết quả bằng điện di nếu thấy có đoạn gen mong muốn (kích thƣớc 336 bp), chúng tôi thực hiện tiếp bƣớc giải trình tự nhằm xác định chính xác đoạn gen của PLRV và khẳng định có sản phẩm phụ hay không.
Việc giải trình tự tiến hành trực tiếp từ sản phẩm RT-PCR, theo nguyên tắc của Sanger. Phƣơng pháp này sử dụng một primer (hoặc sense hoặc antisense) cho một lần giải trình tự. Trong đề tài này, ta sẽ tiến hành giải trình tự bằng cả primer sense lẫn antisense.
Bƣớc 1: Chạy cycle sequencing
- Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng Bigdye 2,5X 2 µl Bigdye buffer 5X 1 µl Sản phẩm PCR 3 - 10 ng Primer 3,2 pmol Nƣớc cho vào để đƣợc thể tích 10 µl
Bigdye 2,5X bao gồm: enzyme kéo dài mẫu, buffer, dNTP và ddNTP. -Mỗi phản ứng chỉ sử dụng hoặc là primer xuôi hoặc là primer ngƣợc Quy trình nhiệt
96oC trong 1 phút 96oC trong 10 giây
50oC trong 5giây 25 chu kỳ 60oC trong 4 phút
Bƣớc 2: Làm sạch sản phẩm cycle sequencing - Cho 2,5 µl / tube EDTA 125 mM vào. - Cho 30 µl / tube ethanol 100% vào, đảo nhẹ. - Để ở nhiệt độ phòng 15 phút
- Ly tâm 12000 vòng trong 30 phút ở 4oC - Loại dịch trong
- Cho 30 µl / tube ethanol 70% vào - Ly tâm 12000 vòng trong 20 phút ở 4oC - Hút bỏ dịch trong và để khô.
Bƣớc 3: Biến tính
- Cho vào mỗi tube 10 µl Hidi formamide. - Biến tính ở 95oC trong 2 phút
- Đƣa nhanh vào đá
Sau đó cho 10 µl mẫu này vào máy giải trình tự. Bƣớc 4: Đọc kết quả
Kết quả giải trình tự sẽ ở dạng peak (mỗi peak đại diện cho 1 nucleotide) và dạng ký tự (A, T, G, C).
Sau khi có trình tự ta tiến hành kiểm tra bằng cách so sánh trình tự giải đƣợc với trình tự có sẵn trên ngân hàng gen (NCBI). Qua đây ta sẽ biết đƣợc trình tự giải đƣợc có phải là virus PLRV không và biết đƣợc mức độ tƣơng đồng giữa trình tự ta có với trình tự trên ngân hàng gene.