4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.3 Kết quả RT-PCR
- Dùng kit ly trích RNA do Bio - Rad cung cấp ta thu đƣợc 80 µl RNA tổng số. - Ta sẽ thu đƣợc 20 µl cDNA sau khi thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA. Thành phần và quy trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA (theo hƣớng dẫn của kit tổng hợp
0 20 40 60 80 100 PVX PVY PLRV Virus T ỷ l ệ ( % ) 1T 1,5T 2T 2,5T 3T
cDNA - iScript cDNA kit). Kết quả thu đƣợc ở lần chạy RT - PCR thứ 3 và có đƣợc những thông số nhƣ sau:
Bảng 4.5 Kết qủa thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA
Thành phần Thể tích
5X iScript reaction Mix Enzyme RNA Nƣớc 4 µl 1 µl 5 µl 10 µl - Lƣợng RNA thích hợp cho phản ứng tổng hợp cDNA là 5 µl.
Quy trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA phải thay đổi so với kit (tăng thời gian của giai đoạn 42oC từ 30 phút lên 40 phút).
Chu kỳ nhiệt trong phản ứng tổng hợp cDNA 25oC trong 5 phút
42oC trong 40 phút 85oC trong 5 phút Giữ ở 4o
C
- Nồng độ hóa chất phù hợp hợp với quy trình đã nêu, kết quả thu đƣợc không có sự hiện diện của sản phẩm phụ. Lƣợng cDNA thích hợp cho phản ứng PCR là 5 µl.
Bảng 4.6 Kết qủa thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA
Thành phần Nồng độ cuối
Dung dịch đệm PCR 10X MgCl2
Hỗn hợp dNTP (dNTP Mix) Mồi xuôi (sens primer) Mồi ngƣợc (antisens primer)
iTaq polymerase Nƣớc 1X 1 mM 0,2 mM 0,3 µM 0,3 µM 1 U / µl Cho vào để đủ 25 µl Tổng thể tích 25 µl
- Kết quả cũng cho thấy quy trình nhiệt là ổn định. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR
- 94oC trong 5 phút -94oC trong 1 phút
- 72oC trong 1 phút - 72oC trong 10 phút
*Kết quả điện di
- Do genome của PLRV không có đuôi poly A, lƣợng cDNA chỉ đƣợc tạo ra từ sự kéo dài các hexamer primer (không có cDNA tạo ra từ primer oligo dT) . Điều này chứng tỏ phản ứng PCR rất nhạy và hiệu quả khuếch đại rất cao.
- Sản phẩm RT - PCR từ quy trình có sử dụng Taq của hãng Bio-rad cho kết quả rất chuẩn. Điều này đƣợc chứng minh bằng kết quả giải trình tự có đƣợc mà không cần tinh sạch sản phẩm RT-PCR.
- Cặp primer đã sử dụng có độ đặc hiệu rất cao, chỉ cho đúng 1 band ở vị trí 336 bp trên gel điện di. Điều này cho phép khẳng định mẫu này đã bị nhiễm virus PLRV.
- Tuy nhiên kết quả trên vẫn còn chƣa thuyết phục lắm. Tức là khả năng tồn tại những đoạn DNA ngoại lai vẫn có thể xảy ra. Do đó để chắc chắn rằng đây là đoạn gen của PLRV ta thực hiện giải trình tự, sau đó so sánh trên ngân hàng gen để có kết luận cuối cùng.
L1: Thang DNA chuẩn 100 bp L2, L3: cDNA của mẫu 10 (P12) L2: Nồng độ Taq polymerase 1,25 U L3 : Nồng độ Taq polymerase 1 U
336bp