72oC 30 giây 72oC 5 phút 15oC Vô cùng
Tiến hành điện di sản phẩm PCR trên gel agarose để kiểm tra chất lượng sản phẩm.
2.8.1.5. Phương pháp giải trình tự gen bằng máy tựđộng
Định nghĩa:
Giải trình tự gen là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotid trên phân tử DNA.
Có nhiều phương pháp giải trình tự gen như: giải trình tự bằng hóa học, bằng enzyme và bằng máy giải trình tự tự động.
Trong đề tài chúng tơi giải trình tự gen mã hóa polEPCA-2 bằng máy tự động
Để thực hiện giải trình tự bằng máy tự động các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để
các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng và sự phát sáng này sẽ được mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ
sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu, cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA.
Với các thế hệ máy mới sau này, người ta có thể dùng 4 màu huỳnh quang
để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện
được chỉ trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng khác nhau như trước[84],[85].
2.8.1.6.Biểu hiện protein tái tổ hợp
Cảm ứng promoter để tế bào E.coli biểu hiện protein tái tổ hợp
Nguyên tắc:
Nuôi cấy các thể biến nạp có vector tái tổ hợp mang gen trong môi
trường có chất cảm ứng promoter để protein tái tổ hợp có thể được tế bào chủ
tổng hợp.
Tiến hành:
Cấy hoạt hóa 1 khuẩn lạc trong mơi trường LB có bổ sung kanamycin (50 mg/mL) với nồng độ cuối là 50 µg/mL, ni lắc ở 37oC qua đêm.
Cấy chuyển 2% chủng vào 2 mL mơi trường LB có bổ sung kháng sinh kanamycin nồng độ là 50 µg/mL và ni lắc ở 37oC để OD đạt 0,5- 0,8 (khoảng 2- 3 giờ).
Hút 1 mL làm đối chứng trước cảm ứng.
Phần còn lại cảm ứng IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)(100
mM) đạt nồng độ cuối là 0,4 mM, lần lượt từng ống nuôi ở 37oC qua đêm.
Thu mẫu sau cảm ứng.
Điện di kiểm tra protein trên gel polyacrylamid 12,6% [86].
Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamid có chất khử (SDS- PAGE)
protein bằng cách bao quanh khung polypeptid và tích điện âm cho nó tỷ lệ
với chiều dài của mạch.Sau khi xử lý các protein đều có dạng hình cầu tích
điện âm với cùng số điện tích trên một đơn vị chiều dài. Nhờ đó, các hỗn hợp protein sau khi biến tính có thể chuyển động trên gel polyacrylamid trong
điện trường theo chiều từ cực âm đến cực dương và tách thành các băng theo
khối lượng phân tử chứkhơng theo điện tích ban đầu của protein.
Để có được độ phân giải cao hơn ta sử dụng cách điện di ngắt quãng với 2 lớp gel cô và gel tách [86].
Tiến hành: *Chuẩn bị gel
Bản gel gồm 2 lớp, một lớp có mạng lưới lớn gọi là gel cô đổ lên trên, một lớp có mạng lưới nhỏ gọi là gel tách được đổ bên dưới. Mỗi lớp có một loại đệm riêng và khác với đệm chạy. Thành phần của mỗi lớp như sau: