Để tạo được vector biểu hiện gen tái tổ hợp, trước hết chúng tôi nuôi hoạt hóa một chủng chứa vector tách dòng mang gen polEPCA-2 và một chủng E.coli chứa vector pET-28a(+) gốc. Sau đó chúng tơi tiến hành tách
plasmid thu lượng lớn 2 loại DNA- plasmid này. Tiếp đó, xử lý 2 loại vector này với 2 enzym cắt giới hạn Nco I và Not I ở nhiệt độ 37oC qua đêm. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 0,8% và tinh sạch (bằng kit Gene JETTM Gel
Extraction Kit (Fermentas) để thu được lượng lớn gen polEPCA-2 và vector
pET-28a(+) với 2 đầu dính tương ứng. Hai sản phẩm sau cắt này sẽ được gắn với nhau nhờ tác dụng của enzyme T4 DNA Ligase. Kết quả sẽ tạo được vector biểu hiện tái tổ hợp như hình 3.2.
Not I Nco I Not I polEPCA-2 (610bp) Vector tách dòng mang gen polEPCA-2 pET-28a(+) (5369bp) pET-28a(+)/polEPCA-2 (5849bp) Nco I
3.1.1.1. Cắt vector tách dòng chứa gen polEPCA-2 và cắt vector biểu hiện pET-28a(+) gốc bằng 2 enzym cắt giới hạn Nco I và Not I
Kết quả điện di sản phẩm phản ứng cắt gen polEPCA-2 từ vector tách dòng và kết quả cắt vector gốc pET-28a(+) được thể hiện trên hình 3.3.
Hình 3.3. Kết quả cắt gen polEPCA-2 và pET-28a(+) bằng 2 enzym Nco I và Not I Giếng 1, 3: Vector pBSK-GS53545/polEPCA-2 và pET-28a(+) gốc. Giếng 2, 4: Vector pBSK-GS53545/polEPCA-2 và pET-28a(+) cắt với Nco I và Not I
M: Marker DNA 1kb
Nhận xét: Trên ảnh điện di hình 3.3 cho thấy ở giếng 2 là sản phẩm cắt từ vector tách dòng tạo ra 2 băng sáng trong đó có một băng kích thước khoảng 610 bp, tương ứng với kích thước lý thuyết của gen polEPCA-2 có 2
đầu dính. Đây là đoạn mong muốn thứ nhất. Ở giếng 4 là sản phẩm cắt từ
vector pET-28a(+) gốc sẽ tạo một đoạn lớn kích thước khoảng 5240 bp và một đoạn ngắn giữa vị trí cắt của 2 enzyme kích thước khoảng 130 bp. Đoạn ngắn này sẽ chạy ra khỏi bản điện di. Kết quả là sản phẩm cắt từ vector pET- 28a(+) gốc sẽ cho 1 băng sáng chứa đoạn lớn có 2 đầu dính. Đây là đoạn mong muốn thứ hai.
3.1.1.2. Tinh sạch bằng phương pháp thôi gel thu gen polEPCA-2 và vector pET-28a(+) với 2 đầu dính tương ứng
Hình 3.4. Kiểm tra sản phẩm tinh sạch gen polEPCA-2 và pET-28a(+)với 2
đầu dính tương ứng. Giếng1:Sản phẩm tinh sạch gen polEPCA-2 với 2 đầu
dính tương ứng. Giếng 2:Sản phẩm tinh sạch vector pET-28a(+) với 2 đầu
dính tương ứng. M: Marker DNA 1kb
Nhận xét:Mỗi sản phẩm tinh sạch chỉ chứa 1 băng duy nhất chứng tỏ
sản phẩm tinh sạch không bị lẫn với các đoạn DNA khác. Ở giếng 1, băng có kích thước khoảng 610 bp, tương ứng với kích thước lý thuyết của gen
polEPCA-2 có 2 đầu dính. Ở giếng 2, băng có kích thước khoảng 5240 bp,
tương ứng kích thước của vector pET-28a(+) với 2 đầu dính. Hai sản phẩm này sẽđược gắn với nhau để tạo vector biểu hiện tái tổ hợp (hình 3.4).
3.1.1.3. Phản ứng gắn gen polEPCA-2 và vector pET-28a(+) với 2 đầu dính tương ứng
Đoạn gen polEPCA-2 có 2 đầu dính sau khi tinh sạch từ gel agarose sẽ được gắn vào vector pET-28a(+) cũng có 2 đầu dính tương ứng nhờ enzyme
Hỗn hợp phản ứng gắn sẽ được biến nạp vào E.coli chủng DH5α.Mục
đích của việc đưa vector biểu hiện tái tổ hợp vào chủng tách dòng E.coli
DH5α là để dễ dàng chọn được dòng mong muốn và thu được lượng lớn bản sao DNA-plasmid của dịng đó rồi mới đưa vào chủng biểu hiện. Làm như
vậy khả năng chúng tôi thu được chủng biểu hiện mang vector biểu hiện có chứa gen polEPCA-2 sẽcao hơn.
3.1.1.4. Chọn dòng tế bào mang gen polEPCA-2
Sản phẩm biến nạp được trải trên mơi trường thạch có chứa kháng sinh
kanamycin để tạo ra khuẩn lạc riêng rẽ và mang vector biểu hiện tái tổ hợp (trên vector này có gen kháng kháng sinh kanamycin). Theo lý thuyết, chỉ những tế
bào chứa vector biểu hiện tái tổ hợp mới mọc được trên môi trường này.
Hình 3.5 thể hiện có 8 khuẩn lạc mọc khi trải sản phẩm biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli chủng DH5α. Các khuẩn lạc này đều có đặc điểm dạng trịn, lồi, màu trắng phù hợp với đặc điểm khuẩn lạc của tế bào E.coli.
Hình 3.5. Đĩa biến nạp vector biểu hiện tái tổ hợp pET28a(+)/polEPCA-2vào
vi khuẩn E. coli chủng DH5α
Chúng tôi lấy 8 khuẩn lạc để kiểm tra bằng phương pháp PCR trực tiếp với cặp mồi của vector pET-28a(+) là T7 F và T7 R. Theo tính tốn trong