CHƯƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Quy trình nhân giống, sản xuất – xử lý BC và cố định lipase trên BC
2.3.1. Quy trình nhân giống và thu nhận BC
Quy trình nhân giống và thu nhận BC ở các thí nghiệm được triến hành theo sơ đồ dưới đây.
Hình 2. 1: Quy trình nhân giống và sản xuất BC (Nguyễn, 2006) Môi trường rắn (Bảng 2.1) Cấy chủng lên MTR Màng BC Ủ (30oC, 72h)
Cấy chủng lên MTL Môi trường lỏng (Bảng 2.1)
Cấy chủng lên MTL
Khuấy từ (30oC, 72h)
Cấy chủng lên MBC
Môi trường thu nhận BC (Bảng 2.2) Ủ (30oC, 168h)
2.3.2. Quy trình xử lý BC trước khi cố định
BC là chất có tính ưa nước trong khi đó lipase lại hoạt động trong mơi trường kỵ nước. Do đó, để enzyme lipase cố định trên BC có thể hoạt động hiệu quả thì cần phải xử lý BC trước khi cố định enzyme lipase lên nhằm tăng tính kỵ nước của BC.
Hình 2. 2: Quy trình xử lý BC trước khi có định (Hu và cộng sự, 2011).
7,7 g BC ướt trong 200 mL nước cất Tiệt trùng (121oC, 15 phút) Màng BC. Để ráo nước Khuấy trộn (80oC, 60 phút) 20 mL acetic andydric có bổ sung iodine 0,125 mM Làm nguội Làm mất màu dung dịch Rửa BC lần 1 Alcohol 75% Rửa BC lần 2 Dung dịch Na2S2O3 bão hoà Nước cất
Sấy BC đã acetyl hố (60oC, 12h)
2.3.3. Quy trình cố định lipase
Hình 2. 3: Quy trình cố định enzyme lipase trên BC đã xử lý (Hu và cộng sự, 2011)
2 mL enzyme lipase 5 mg/mL (pha trong Na3PO4
100 mM, pH 7)
1 g BC đã acetyl hoá
Khuấy trộn (25oC, 24h trong tối)
Rửa BC Đệm Na3PO4 100 mM, pH 7
Sấy (60oC, 4h)
Màng BC đã được cố định enzyme
2.4. Nội dung nghiên cứu 2.4.1. Sơ đồ nghiên 2.4.1. Sơ đồ nghiên
Hình 2. 4: Sơ đồ nghiên cứu
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng các chế độ khuấy đến khả năng thu nhận BC
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ vi
sinh vật ban đầu đến khả năng thu nhận BC
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pH mơi
trường đến sự sinh tổng hợp BC
Thí nghiệm 4: Khảo sát hiệu suất cố định enzyme
Thí nghiệm 5: Khảo sát hoạt độ enzyme lipase cố
2.4.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các chế độ khuấy đến khả năng thu BC thích hợp thích hợp
Mục đích:
Tùy vào chế độ khuấy trộn khác nhau mà hình dạng, kích thước, khối lượng, hiệu suất thu nhận BC có thể sẽ khác nhau (Yoshino và cộng sự, 1996; Shoda và cộng sự, 2005). Thí nghiệm này nhằm khảo sát chế độ khuấy thích hợp để năng suất thu hồi màng BC cao nhất.
Cách tiến hành: Gluconacetobacter xylinus được cấy vào MBC đã được chuẩn bị với
nồng độ giống cấy ban đầu là 0,04g/L. Các chế độ khuấy trộn khác nhau được trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2. 3: Bố trí thí nghiệm 1
Tên thí nghiệm Chế độ khảo sát Thông số khảo sát
A1 Ủ tĩnh Lấy mẫu mỗi 24 giờ để xác định mật độ sinh khối trong môi trường lỏng, khối lượng BC và hàm lượng đường cịn lại trong mơi trường.
A2 Khuấy từ A3 Lắc 100 rpm A4 Lắc 150 rpm A5 Lắc 200 rpm
2.4.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi sinh vật ban đầu đến khả năng thu nhận BC thu nhận BC
Mục đích:
Khi nồng độ vi sinh vật tăng thì lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích sẽ tăng lên, đồng nghĩa với việc sẽ có nhiều hơn lượng vi khuẩn tham gia sản xuất cellulose. Tuy nhiên, khi nồng độ vi sinh vật tăng quá cao thì lượng chất dinh dưỡng, khí oxy, khơng gian phát triển của chúng sẽ bị hạn chế dẫn đến chúng sẽ cạnh tranh và ức chế lẫn nhau làm cho hiệu suất nuôi cấy sẽ giảm xuống (Seto và cộng sự, 1985). Thí nghiệm này nhằm khảo sát nồng độ vi sinh vật ban đầu tối ưu để hiệu suất thu được BC lớn nhất.
Cách tiến hành: Gluconacetobacter xylinus được cấy vào MBC đã được chuẩn bị với
nồng độ giống cấy ban đầu khác nhau như trình bày ở Bảng 2.4. Chế độ khuấy trộn lựa chọn là chế độ tốt nhất thu được ở TN 1.
Bảng 2. 4: Bố trí thí nghiệm 2
Tên thí nghiệm Nồng độ sinh khối khô
ban đầu (mg/L) Thông số khảo sát
B1 0,001 g/L Lấy mẫu mỗi 24 giờ để xác định mật độ sinh khối trong môi trường lỏng, khối lượng BC và hàm lượng đường còn lại trong môi trường.
B2 0,004 g/L B3 0,007 g/L B4 0,1 g/L
2.4.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh tổng hợp BC Mục đích: Mục đích:
Độ pH của môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn dẫn đến hiệu suất thu nhận BC cũng thay đổi tùy thuộc vào pH của môi trường (Jin và cộng sự, 2019). Trong các nghiên cứu trước đây, người ta thường nuôi cấy và khảo sát vi khuẩn G.
xylinus nhiều nhất ở pH 4 – 6. Thí nghiệm này khảo sát độ pH môi trường tối ưu để thu nhận
BC.
Cách tiến hành: Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường MBC với pH thay đổi từ 4
– 6. Nồng độ sinh khối ban đầu được lựa chọn dựa vào kết quả ở thí nghiệm 2. Mỗi thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần.
Bảng 2. 5: Bố trí thí nghiệm 3
Tên thí nghiệm pH mơi trường ban đầu Thông số khảo sát
C1 4 Lấy mẫu mỗi 24 giờ để xác định mật độ sinh khối trong môi trường lỏng, khối lượng BC và hàm lượng đường cịn lại trong mơi trường.
C2 5
C3 6
2.4.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát hiệu suất cố định enzyme lipase
Mục đích: Thí nghiệm này nhằm chứng minh hiệu suất cố định enzyme lipase trên
màng BC
BC thu nhận được trong sẽ được xử lý (acetyl hóa) theo quy trình đã trình bày ở mục 2.3.2. Sau đó enzyme lipase sẽ được cố định trên BC theo quy trình trình bày ở mục 2.3.3.
- Thông số khảo sát: Xác định cấu trúc bề mặt của màng bằng kính hiển vi điện tử quét
SEM Scanning Electron Microscope)
- Xác định cấu trúc của màng trước và sau khi xử lý acetyl hóa bằng phương pháp FTIR (Fourier-transform infrared spectroscopy),
- Nồng độ enzyme trong dung dịch sau khi cố định.
2.4.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát hoạt độ enzyme lipase cố định trên BC
Mục đích: TN này nhằm chứng minh enzyme lipase vẫn có hoạt độ thủy phân sau khi được
cố định trên BC, từ đó so sánh hoạt độ của enzyme lipase cố định trên BC với enzyme lipase tự do.
Cách tiến hành:
Hoạt độ của enzyme lipase tự do và enzyme lipase cố định trên BC được xác định bởi phương pháp của Soares (1999).
Thông số khảo sát: VNaOH 2.5. Phương pháp phân tích
2.5.1. Phương pháp thu hồi, xác định hàm lượng sinh khối và BC
Sau mỗi 24h lấy mẫu dịch mơi trường đo OD620nm. Sau đó ly tâm thu hồi sinh khối và BC của bình ni cấy ở tốc độ 4000rmp trong 15 phút. Sinh khối và BC được sấy đối lưu ở 60oC đến khối lượng không đổi. Vẽ đồ thị xác định mối trương quan giữa sinh khối, BC và OD620nm.
2.5.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate
Định lượng tổng carbohydrate cịn xót lại bằng phương pháp phenol – sulfuric acid (Nielsen, 2010).
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên cơ sở tổng carbohydrate bao gồm đường đơn, oligosaccharides, polysaccharides và các dẫn xuất của chúng phản ứng với sulfuric acid và sinh ra nhiệt để cho ra các dẫn xuất furan ngưng tụ với phenol tạo thành các hợp chất ổn định màu vàng có thể đo được bằng phương pháp quang phổ.
Hóa chất:
Dung dịch glucose chuẩn 100 mg/L. Acid sulfuric đậm đặc.
Phenol 80% (w/w) trong nước: pha bằng cách thêm 20 g nước cất vào 80 g tinh thể phenol tinh khiết.
Quy trình:
Cho 1 ml mẫu (pha loãng bằng nước cất nếu nồng độ glucose chứa trong mẫu vượt quá 50 mg/mL) vào ống nghiệm khơ, sạch; sau đó bổ sung thêm 1 ml nước cất. Sau đó, bổ sung thêm 0,05mL phenol 80% lắc đều ống nghiệm. Thêm nhanh 5 mL sulfuric acid vào ống nghiệm chứa hỗn hợp trên, lắc đều ống nghiệm, để đứng ống nghiệm trong 10 phút và làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng. Cuối cùng đem mẫu đi đo ở bước sóng 490 nm, ghi nhận lại độ hấp thu rồi so sánh với đường chuẩn có khoảng nồng độ glucose từ 0 đến 50 mg/L.
2.5.3. Xác định hoạt độ enzyme lipase tự do và enzyme lipase đã được cố định
Sử dụng phương pháp chuẩn độ với cơ chất là dầu olive (Soares và cộng sự, 1999).
Hóa chất:
Dung dịch A: 50 ml dầu olive, 50 ml gum arabic Dung dịch đệm: Na3PO4 100 mM, pH 7,0 Dung dịch B: hỗn hợp acetone – ethanol (1:1) KOH 25 mM
Phenolphthalein
Qui trình:
Hỗn hợp phản ứng bao gồm 5 ml dung dịch A, 2 ml dung dịch đệm Na3PO4 phản ứng với 1 ml enzyme tự do (5 mg/mL) hoặc enzyme lipase đã được cố định (100 – 250 mg) được ủ trong 20 phút ở 37℃. Kết thúc phản ứng bằng cách bổ sung thêm 10 ml dung dịch B. Acid béo giải phóng được chuẩn độ bằng dung dịch NaOH.
Đơn vị hoạt độ enzyme (U) được định nghĩa là lượng enzyme thủy phân ra 1 mol acid béo tự do trong 1 phút dưới điều kiện khảo sát (Soares và cộng sự, 1999).
𝑛𝑎𝑐𝑖𝑑 𝑏é𝑜 𝑡ự 𝑑𝑜(mol) = 𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻× 𝑁 × 1000 (2.1) menzyme (mg) = { 5 , đố𝑖 𝑣ớ𝑖 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒 𝑡ự 𝑑𝑜 100, đố𝑖 𝑣ớ𝑖 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒 𝑐ố đị𝑛ℎ (2.2) 1𝑈 = 𝑚𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒 𝑡ự 𝑑𝑜 (𝑚𝑔) 𝑛𝑎𝑐𝑖𝑑 𝑏é𝑜 𝑡ự 𝑑𝑜( mol) 𝑡(𝑝ℎú𝑡) (2.3)
2.5.4. Hiệu suất cố định
Đo hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry (Waterborg, 2009).
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên cả phản ứng Biuret, trong đó các liên kết peptide của protein phản ứng với đồng trong điều kiện kiềm để tạo ra Cu+ với việc khử thuốc thử Folin – Ciocalteau phenol (phosphomolybdic-phosphotungstic acid) của tyrosine và dư lượng tryptophan trong protein, về bản chất là phosphomolybdic-phosphotungstic acid bị khử thành màu xanh do q trình oxy hóa của các axit amin thơm được xúc tác bởi đồng. Các phản ứng cho đến khi xuất hiện màu xanh đậm, phụ thuộc một phần vào hàm lượng tyrosine và tryptophan. Phương pháp này nhạy cảm với khoảng 0,01 mg protein/mL, và được sử dụng tốt nhất trên các dung dịch có nồng độ trong khoảng 0,01101 mg/mL protein (Waterborg, 2009).
Hóa chất:
Thuốc thử tạo phức: Chuẩn bị ngay trước khi sử dụng bằng cách trộn các dung dịch gốc sau theo tỷ lệ 100: 1: 1 (theo vol), tương ứng:
Dung dịch A: 2% (w/v) Na2CO3 trong nước cất. Dung dịch B: 1% (w/v) CuSO4.5H2O trong nước cất. Dung dịch C: 2% (w/v) natri kali tartrate trong nước cất. NaOH 2N.
Thuốc thử Folin 1 N.
Mẫu chuẩn: Sử dụng dung dịch protein albumin lịng trắng trứng có nồng độ 2 mg/mL trong nước cất, được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 20 ° C.
Quy trình:
Để 0,1 mL mẫu hoặc mẫu chuẩn, thêm 0,1 mL NaOH 2 N. Thủy phân ở 100 ° C trong 10 phút trong bể điều nhiệt. Làm nguội dịch thủy phân đến nhiệt độ phòng và thêm 1 mL thuốc thử tạo phức phức hợp mới. Để dung dịch ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Thêm 0,1 mL thuốc thử Folin, trộn đều hỗn hợp và để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Cuối cùng đọc độ hấp thụ ở 750nm. Từ kết quả thu được xác định hiệu suất cố định enzyme.
2.5.5. Đặc tính cấu trúc của BC
BC được sấy đối lưu ở 60oC và phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). 10mg mẫu BC khô được chụp SEM ở Saigon Hi-Tech Park Training Center, phường Tân Phú, Quận 9, Thành phố Hồ Chí Minh. Mẫu BC được gắn với carbon và bọc bằng platinum để cải thiện
hiệu quả quan sát. Bề mặt và thành phần của mẫu được quan sát lần lượt ở 1kV và 5Kv (Cai và cộng sự, 2018).
2.5.7. Phương pháp đo quang phổ FTIR
Phổ FTIR (Fourier Transform Infrared) của màng BC được đo bằng thiết bị FI-IR 4700, Jasco, Nhật Bản. Dữ liệu độ truyền qua được tiến hành trong phạm vi số sóng từ 400 – 4000 cm-1. Kết quả đo phổ được hiển thị đưới dạng biểu đồ bằng phần mềm Origin 2019.
2.5.7. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu sau khi thu được từ các thí nghiệm tính tốn xử lý bằng các phần mềm thống kê như: SPSS, ANOVA, EXCEL
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Ảnh hưởng các chế độ khuấy đến khả năng thu BC thích hợp 3.1. Ảnh hưởng các chế độ khuấy đến khả năng thu BC thích hợp
Tốc độ tăng mật độ sinh khối trong môi trường lỏng ở các chế độ khảo sát được xác định bằng cách lấy mẫu dung dịch môi trường để đo độ hấp thu quang học (OD) sau mỗi 24h ni cấy (hình 3.1a)
(a) (b)
Hình 3. 1: Đồ thị biểu diễn sinh khối (a) và BC (b) sau mỗi 24 h
Vi sinh vật ni cấy ở chế độ khuấy từ có tốc độ sinh trưởng, phát triển sinh khối nhanh nhất vì ở chế độ này mơi trường lỏng được đảo trộn liên tục, được cung cấp và khuếch tán oxy đồng đều trong dịch lỏng môi trường. Sinh khối được cấy vào ban đầu là 0,04 g/L, chúng sinh trưởng và phát triển nhanh chóng và đạt đến nồng độ 0,7426 g/L sau 4 ngày ni cấy sau đó thì tốc độ sinh trưởng của chúng chậm lại và lượng sinh khối tăng lên cho đến ngày thứ 7 là không đáng kể với hàm lượng 0,7807 g/L do lúc này hàm lượng chất dinh dưỡng có trong mơi trường đã suy giảm đáng kể. Ở chế độ nuôi cấy lắc với tốc độ 200 rpm, vi sinh vật sinh trưởng và phát triển khá chậm và chỉ tăng hàm lượng từ 0,04 g/L đến 0,1270 g/L ở 3 ngày nuôi cấy đầu tiên. Ở 2 ngày tiếp theo, tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật tăng lên khá cao và đạt nồng độ cực đại với 0,3402 g/L ở ngày thứ 5. Sau đó, hàm lượng vi sinh vật trong mơi trường thay đổi không đáng kể ở 2 ngày nuôi cấy cuối cùng. Ở ba chế độ khảo sát còn lại, tốc độ sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật rất chậm và hầu như khơng có thay đổi đáng kể về nồng độ sinh khối trong suốt q trìn ni cấy. Như vậy, trong các chế độ ni cấy được khảo sát thì hiệu suất thu hồi sinh khối trong mơi trường lỏng của chế độ khuấy từ là cao nhất với hiệu suất là 0,1115 g/L/ngày cao hơn nhiều so với chế độ có hiệu suất thu hồi cao thứ 2 là chế độ lắc 200 rpm với hiệu suất thu hồi là 0,0486 g/L/ngày.
BC là polymer tự nhiên được tổng hợp trong quá trình sinh trưởng và phát triển cuả vi sinh vật. Khả năng tổng hợp BC của vi sinh vật được xác định bằng cách thu BC tạo ra sau mỗi 24h và đem đi cân lấy khối lượng. Ở chế độ ủ tĩnh, tuy mật độ sinh khối của vi sinh vật trong mơi trường lỏng thấp và hầu như khơng có thay đổi đáng kể trong suốt quá trình cấy nhưng tốc độ và hàm sau 7 ngày là cao nhất trong tất cả các chế độ khảo sát với hàm lượng 14,8472 g/L vì ở chế độ này, hầu hết lượng đường được vi sinh vật tập trung sử dụng để sinh BC trên bề mặt dịch lỏng mơi trường. Trong khi đó, chế độ khuấy từ có mật độ vi sinh vật trong dịch lỏng và tốc độ sinh trưởng nhanh nhất nhưng lại không tạo được BC trong quá trình nuối cấy vì ở chế độ này, dịch lỏng được khuấy đảo liên tục với vận tốc khuấy cao nên lượng BC nhỏ vừa tạo ra đã bị khuếch tán đều trong dịch lỏng mơi trường, khơng thể tạo ra BC có hình dạng, kích thước và khối lượng lớn. Bên cạnh đó, tổng hàm lượng đường giảm mạnh tỷ lệ thuận với tốc độ và hàm lượng BC tạo ra ở mỗi chế độ khảo sát do vi sinh vật sử dụng đường để sinh trưởng và phát triển, tổng hợp sản phẩm BC (hình 3.2). Cụ thể, tổng hàm lượng đường ở chế độ ủ tĩnh giảm nhanh và nhiều nhất trong khi đó hàm lượng đường ở chế độ khuấy từ giảm chậm và không quá đáng kể.
Hình 3. 2: Đồ thị biểu diễn tổng hàm lượng đường sau mỗi 24h.
Như vậy, với mục đích của đề tài là khảo sát q trình thu nhận BC với hiệu suất lớn nhất thì chế độ ủ tĩnh sẽ được lựa chọn để tiến hành cho các thí nghiệm khảo sát các điều kiện tiếp theo.
3.2. Ảnh hưởng nồng độ vi sinh vật ban đầu đến khả năng thu nhận BC
Khi nồng độ vi sinh vật tăng thì lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích sẽ tăng