CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.4. Khảo sát hiệu suất cố định enzyme lipase
Để xác định xem có sự thay đổi cấu trúc của BC sau khi đã được xử lý acetyl hóa, cấu trúc hóa học và cấu trúc bề mặt của BC trước và sau khi xử lý được phân tích.
Cấu trúc bề mặt
Hai mẫu BC chưa được xử lí và BC đã được xử lí bề mặt đều được sấy khô đến khối lượng không đổi ở 600C trong 12 giờ. Sau đó cả 2 mẫu được gửi đến khu công nghệ cao quận 9 để tiến hành chụp SEM. Từ kết quả chụp SEM ở hình (3.7) với cùng độ phóng đại thì mẫu (a) và mẫu (b) có độ khác biệt về cấu trúc của màng BC, các sợi cellulose của mẫu BC đã
acetyl hố được tách rời ra (Hình 3.7b). Sự thay đổi này là do nhóm -OH đã được thay thế bằng nhóm acetyl làm cho BC từ rất ưa nước sang kỵ nước hơn. Hay nói cách khác, khả năng thấm nước của BC sẽ giảm mạnh sau khi được acetyl hoá, điều này khẳng định rằng sự biến đổi hoá học đã xảy ra trên bề mặt của màng BC. Màng BC được acetyl hoá với bề mặt kỵ nước có khả năng hoạt động tốt với mơi trường kỵ nước, từ đó giúp cho enzyme lipase dễ dàng hoạt động hơn trong môi trường ưa béo (Hu và cộng sự, 2011).
(a) (b)
Hình 3. 7: Kết quả chụp SEM của BC (a) và BC đã được acetyl hóa (b)
Cấu trúc hóa học:
Để xác định có sự xuất hiện của gốc acetyl trên BC sau khi xử lý hay không, chúng tôi sử dụng phổ hồng ngoại FTIR để xác định các nhóm chức chính của BC trước và sau khi xử lý.
Hình (3.8) cho thấy phổ FTIR của mẫu BC và mẫu BC đã acetyl hoá. Kết quả cho thấy một vùng hấp thụ rộng và mạnh nằm giữa 3200-3600 cm-1 là do sự hấp thụ của nhóm O–H duỗi thẳng. Sự hấp thụ này được tạo ra do có sự thay thế một phần các gốc hydroxyl thành gốc acetyl trong phân tử (Hu và cộng sự, 2011). Đỉnh 1367 cm-1 là do có sự uốn cong của liên kết methyl ở -O(C=O)-CH3, đồng thời dải hấp thụ từ 1205 cm-1 đến 1105 cm-1 được cho là do có sự kéo dãn liên kết C-O của các nhóm acetyl. Ngồi ra, các đỉnh 1425 và 1563 cm-1 cho thấy rằng trong mẫu có chứa nhóm carboxylate tồn tại tên bề mặt, và đỉnh 1030 cm-1 cịn có thể liên quan đến nhóm chức năng C-O-C của ether (Moosavi-Nasab và cộng sự, 2010).
Hình 3. 8: So sánh phổ FTIR giữa mẫu BC và BC đã được acetyl hóa
Enzyme có bản chất là protein vì vậy thông qua việc xác định hàm lượng protein có trong dung dịch enzyme cịn dư sau khi cố định có thể gián tiếp xác định được lượng enzyme có trong các mẫu cần khảo sát. Hàm lượng protein của các mẫu enzyme lipase được thể hiện ở bảng 3.2
Bảng 3. 1: Hàm lượng protein trong các mẫu enzyme tự do (5mg/mL), BC, enzyme cố định trên BC, enzyme cố định trên BC acetyl hóa
Mẫu Hàm lượng protein (g/mL)
Enzyme tự do (5mg/ml) 240,580 Enzyme dư sau khi cố định lên BC 229,476 Enzyme dư sau khi cố định lên BC acetyl hóa 66,252
Lượng protein có trong dung dịch enzyme dư sau khi thực hiện cố định lên BC đã qua acetyl hóa là 66,252 g/mL, thấp hơn nhiều so với lượng protein trong dung dịch enzyme dư của mẫu cố định trên BC với 229,476 g/mL. Điều này cho thấy bề mặt BC đã qua xử lý acetyl hóa có khả năng tương thích tốt hơn với enzyme lipase so với BC nguyên bản. Vì vậy, hiệu suất cố định enzyme lipase trên BC nguyên bản chỉ khoảng 38% trong khi đó hiệu suất cố định enzyme này trên BC đã qua xử lý acetyl hóa là 82,1%.
3.5. Khảo sát hoạt độ enzyme lipase cố định trên BC
Bảng 3. 2: Hoạt độ enzyme lipase của các mẫu enzyme tự do, enzyme cố định trên BC và enzyme cố định trên BC acetyl hóa
Mẫu Hoạt độ enzyme (U)
Lipase tự do 7,6x10-4 Lipase cố định trên BC 8,2x10-4 Lipase cố định trên BC acetyl hóa 7,3x10-4
Một đơn vị hoạt độ enzyme lipase (U) được định nghĩa là lượng enzyme lipase cần thiết để tạo ra 1 mol acid béo tự do trong 1 phút ở điều kiện khảo sát (Soares và cộng sự, 1999). Do đó, enzyme có số đơn vị U càng thấp thì hoạt độ của nó càng cao. Với kết quả thu được cho thấy enzyme lipase sau khi được cố định trên BC vẫn cịn giữ được hoạt độ của nó. Đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng enzyme cố định có hoạt độ cao hơn so với enzyme tự do (da Silva và cộng sự, 2008). Bên cạnh đó, với hiệu suất cố định enzyme cao hơn nhiều so với BC nguyên bản, lipase cố định trên BC acetyl hóa, lượng enzyme được gắn trên BC acetyl hóa là lớn hơn. Do đó, hoạt độ của enzyme lipase cố định trên BC acetyl hóa là cao nhất với 7,3x10-4 U và lipase cố định trên BC nguyên bản có hoạt độ thấp nhất với 8,2x10-4 U.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Chủng vi sinh vật Gluconacetobacter xylinus đã được nghiên cứu khá nhiều ở cả trong nước và trên thế giới về quá trình thu nhận BC với các điều kiện ni cấy khác nhau. Thơng qua các thí nghiệm đã thực hiện, có thể kết luận về điều kiện nuôi cấy tốt nhất để thu BC mà nghiên cứu đã khảo sát đó là ni cấy chủng vi sinh vật này ở 30˚C, mơi trường ni cấy có pH bằng 4, nồng độ vi sinh vật ban đầu được cấy vào môi trường lỏng là 0,04 g/L, ủ tĩnh trong 7 ngày liên tiếp.
Quá trình ni cấy vi khuẩn để thu BC cũng như phương pháp cố định enzyme được sử dụng trong nghiên cứu này có thể được thực hiện một cách đơn giản, chi phí thấp khi so sánh với các vật liệu cố định đắt tiền như acrylic resin (Poojari và cộng sự, 2013), hạt nano Fe3O4 (Xie và cộng sự, 2009). Tuy nhiên, hiệu suất cố định enzyme lipase lên BC đã qua xử lý bề mặt bằng phương pháp acetyl hóa lên đến 82,5%, cao hơn đáng kể so với hiệu suất 47% của nghiên cứu cố định enzyme lipase trên vật liệu alginate/BC trước đây (Kim và cộng sự, 2017). Bên cạnh đó, hoạt độ enzyme lipase cố định trên BC ghi nhận được cũng cao hơn so với hoạt độ enzyme tự do. Vì vậy, có thể nói rằng BC là vật liệu phù hợp và rất tiềm năng để ứng dụng trong việc cố định enzyme lipase trên quy mơ phịng thí nghiệm cũng như quy mơ thương mại bởi các đặc tính sinh học cũng như lợi ích kinh tế mà nó đem lại.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Aravindan, R., et al. (2007). "Lipase applications in food industry."
2. Barud, H. S., et al. (2008). "Thermal behavior of cellulose acetate produced from homogeneous acetylation of bacterial cellulose." 471(1-2): 61-69.
3. Bayazidi, P., et al. (2018). "Immobilization of lysozyme on bacterial cellulose nanofibers: Characteristics, antimicrobial activity and morphological properties." 107: 2544-2551. 4. Biswas, A., et al. (2005). "Solvent-free process to esterify polysaccharides." 6(4): 1843-
1845.
5. Cai, Q., et al. (2018). "Enhanced activity and stability of industrial lipases immobilized onto spherelike bacterial cellulose." 109: 1174-1181.
6. Campano, C., et al. (2016). "Enhancement of the fermentation process and properties of bacterial cellulose: a review." 23(1): 57-91.
7. Cannon, R. E. and S. M. J. C. r. i. m. Anderson (1991). "Biogenesis of bacterial cellulose." 17(6): 435-447.
8. Casas-Godoy, L., et al. (2018). Lipases: an overview. Lipases and Phospholipases, Springer: 3-38.
9. Chawla, P. R., et al. (2009). "Microbial cellulose: fermentative production and applications." 47(2): 107-124.
10. Cho, S. and N. Almeida (2012). Dietary fiber and health, CRC Press.
11. Czaja, W. K., et al. (2007). "The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications." 8(1): 1-12.
12. da Silva, V. C., et al. (2008). "Characterization and catalytic activity of free and immobilized lipase from Aspergillus niger: a comparative study." 19(8): 1468-1474. 13. Drozd, R., et al. (2018). "The application of magnetically modified bacterial cellulose
for immobilization of laccase." 108: 462-470.
14. Esa, F., et al. (2014). "Overview of bacterial cellulose production and application." 2:
113-119.
15. Fontana, J. D., et al. (2017). New insights on bacterial cellulose. Food biosynthesis, Elsevier: 213-249.
16. Gargouri, Y., et al. (1989). "Gastric lipases: biochemical and physiological studies."
17. Gonỗalves Filho, D., et al. (2019). "Lipases: sources, immobilization methods, and industrial applications." 103(18): 7399-7423.
18. Gonzalez-Alfonso, J. L., et al. (2018). Lipase-Catalyzed Synthesis of Fatty Acid Esters of Trisaccharides. Lipases and Phospholipases, Springer: 287-296.
19. Haki, G. and S. J. B. t. Rakshit (2003). "Developments in industrially important thermostable enzymes: a review." 89(1): 17-34.
20. Hasan, F., et al. (2010). "Enzymes used in detergents: lipases." 9(31): 4836-4844. 21. Hu, W., et al. (2011). "Solvent-free acetylation of bacterial cellulose under moderate
conditions." 83(4): 1575-1581.
22. Ifuku, S., et al. (2007). "Surface modification of bacterial cellulose nanofibers for property enhancement of optically transparent composites: dependence on acetyl- group DS." 8(6): 1973-1978.
23. Iguchi, M., et al. (2000). "Bacterial cellulose—a masterpiece of nature's arts." 35(2): 261- 270.
24. Iso, M., et al. (2001). "Production of biodiesel fuel from triglycerides and alcohol using immobilized lipase." 16(1): 53-58.
25. Jagannath, A., et al. (2008). "The effect of pH, sucrose and ammonium sulphate concentrations on the production of bacterial cellulose (Nata-de-coco) by Acetobacter xylinum." 24(11): 2593.
26. Jagannath, A., et al. (2010). "Comparative evaluation of bacterial cellulose (nata) as a cryoprotectant and carrier support during the freeze drying process of probiotic lactic acid bacteria." 43(8): 1197-1203.
27. Jin, Y. H., et al. (2019). "Improved production of bacterial cellulose from waste glycerol through investigation of inhibitory effects of crude glycerol-derived compounds by Gluconacetobacter xylinus." 75: 158-163.
28. Jonas, R. and L. F. Farah (1998). "Production and application of microbial cellulose." Polymer Degradation and Stability 59: 101 - 106.
29. Jonas, R., et al. (1998). "Production and application of microbial cellulose." 59(1-3): 101-106.
30. Kato, N., et al. (2007). "Viability and cellulose synthesizing ability of Gluconacetobacter xylinus cells under high-hydrostatic pressure." 11(5): 693-698.
31. Kersters, K., et al. (2006). "The family acetobacteraceae: the genera acetobacter, acidomonas, asaia, gluconacetobacter, gluconobacter, and kozakia." 5: 163-200. 32. Kim, J. H., et al. (2017). "Alginate/bacterial cellulose nanocomposite beads prepared
using Gluconacetobacter xylinus and their application in lipase immobilization." 157:
137-145.
33. Krystynowicz, A., et al. (2002). "Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose." 29(4): 189-195.
34. Lee, D.-W., et al. (1999). "Isolation and characterization of a thermophilic lipase from Bacillus thermoleovorans ID-1." 179(2): 393-400.
35. Lin, S.-P., et al. (2013). "Biosynthesis, production and applications of bacterial cellulose." 20(5): 2191-2219.
36. Linko, Y.-Y., et al. (1998). "Biodegradable products by lipase biocatalysis." 66(1): 41-50. 37. Liu, C.-H., et al. (2009). "Characterization of Burkholderia lipase immobilized on
celite carriers." 40(4): 359-363.
38. Mamura, S. and S. J. J. B. Kitaura (2000). "Purification and characterization of monoacylglycerol lipase from the moderately thermophilic Bacillus species H-2575."
127: 419-425.
39. Meftahi, A., et al. (2010). "The effects of cotton gauze coating with microbial cellulose." 17(1): 199-204.
40. Moayedallaie, S., et al. (2010). "Bread improvers: Comparison of a range of lipases with a traditional emulsifier." 122(3): 495-499.
41. Moosavi-Nasab, M., et al. (2010). "Investigation of physicochemical properties of the bacterial cellulose produced by Gluconacetobacter xylinus from date syrup." 44:
1258-1263.
42. Nguyễn, T. H. (2008). "Ảnh hưởng của nguồn cơ chất và kiểu lên men đến năng suất và chất lượng cellulose vi khuẩn."
43. Nguyễn, T. H. J. L. á. t. s. s. h., ĐHQG TP. HCM (2006). "Tuyển chọn và cải thiện các chủng Acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng quy mô pilot."
44. Nguyễn, T. H. J. T. c. D. t. h. v. ứ. d. (2003). "Phạm Thành Hổ, Chọn lọc dịng Acetobacter xylinum thích hợp cho các loại mơi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn." 3: 49.
45. Nielsen, S. S. (2010). Food analysis, Springer.
46. Okiyama, A., et al. (1992). "Bacterial cellulose II. Processing of the gelatinous cellulose for food materials." 6(5): 479-487.
47. Ortiz, C., et al. (2019). "Novozym 435: the “perfect” lipase immobilized biocatalyst?"
9(10): 2380-2420.
48. Poojari, Y., et al. (2013). "Thermal stability of Candida antarctica lipase B immobilized on macroporous acrylic resin particles in organic media." 2(1): 7-11. 49. Reis, P., et al. (2009). "Lipases at interfaces: a review." 147: 237-250.
50. Rezaee, A., et al. (2008). "Microbial cellulose as support material for the immobilization of denitrifying bacteria." 7(5).
51. Rodrigues, R. C. and R. J. J. o. m. c. B. E. Fernandez-Lafuente (2010). "Lipase from Rhizomucor miehei as a biocatalyst in fats and oils modification." 66(1-2): 15-32. 52. Ruka, D. R., et al. (2012). "Altering the growth conditions of Gluconacetobacter
xylinus to maximize the yield of bacterial cellulose." 89(2): 613-622.
53. Salgado, L. F. (2015). Genetic analysis of cellulose crystallization in Gluconacetobacter xylinus, University of Ontario Institute of Technology (Canada). 54. Sarney, D. B., et al. (1994). "Lipase-catalyzed synthesis of lysophospholipids in a
continuous bioreactor." 71(1): 93-96.
55. Schmid, R. D. and R. J. A. C. I. E. Verger (1998). "Lipases: interfacial enzymes with attractive applications." 37(12): 1608-1633.
56. Seto, M., et al. (1985). "Effect of bacterial density and substrate concentration on yield coefficients." 50(5): 1132-1136.
57. Sharma, R., et al. (2001). "Production, purification, characterization, and applications of lipases." 19(8): 627-662.
58. Shimada, Y., et al. (1999). "Conversion of vegetable oil to biodiesel using immobilized Candida antarctica lipase." 76(7): 789-793.
59. Shoda, M., et al. (2005). "Recent advances in bacterial cellulose production." 10(1):
1.
60. Singh, A. K., et al. (2012). "Overview of fungal lipase: a review." 166(2): 486-520. 61. Soares, C. M., et al. (1999). Characterization and utilization of Candida rugosa lipase
immobilized on controlled pore silica. Twentieth Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, Springer.
62. Sun, D., et al. (2010). "Bacterial cellulose/TiO2 hybrid nanofibers prepared by the surface hydrolysis method with molecular precision." 2(2): 287-292.
63. Ul-Islam, M., et al. (2019). "Comparative study of plant and bacterial cellulose pellicles regenerated from dissolved states." 137: 247-252.
64. Ullah, H., et al. (2016). "Applications of bacterial cellulose in food, cosmetics and drug delivery." 23(4): 2291-2314.
65. Vakhlu, J. J. E. J. o. B. (2006). "Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning." 9(1): 0-0.
66. Vandamme, E., et al. (1998). "Improved production of bacterial cellulose and its application potential." 59(1-3): 93-99.
67. Wang, J., et al. (2019). "Bacterial cellulose production, properties and applications with different culture methods–A review." 219: 63-76.
68. Waterborg, J. H. (2009). The Lowry method for protein quantitation. The protein protocols handbook, Springer: 7-10.
69. Wu, S.-C. and Y.-K. J. J. o. M. C. B. E. Lia (2008). "Application of bacterial cellulose pellets in enzyme immobilization." 54(3-4): 103-108.
70. Xie, W., et al. (2009). "Immobilized lipase on Fe3O4 nanoparticles as biocatalyst for biodiesel production." 23(3): 1347-1353.
71. Yamada, Y., et al. (1997). "The phylogeny of acetic acid bacteria based on the partial sequences of 16S ribosomal RNA: the elevation of the subgenus Gluconoacetobacter to the generic level." 61(8): 1244-1251.
72. Yao, W., et al. (2011). "Bacterial cellulose membrane–A new support carrier for yeast immobilization for ethanol fermentation." 46(10): 2054-2058.
73. Yoshinaga, F., et al. (1997). "Research progress in production of bacterial cellulose by aeration and agitation culture and its application as a new industrial material." 61(2): 219-224.
74. Yoshino, T., et al. (1996). "Cellulose production by Acetobacter pasteurianus on silicone membrane." 81(1): 32-36.
75. Zakaria, J. and M. Nazeri (2012). Optimization of bacterial cellulose production from pineapple waste: effect of temperature, pH and concentration. 5th Engineering Conference," Engineering Towards Change-Empowering Green Solutions.