CHƯƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Phương pháp phân tích
2.5.4. Hiệu suất cố định
Đo hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry (Waterborg, 2009).
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên cả phản ứng Biuret, trong đó các liên kết peptide của protein phản ứng với đồng trong điều kiện kiềm để tạo ra Cu+ với việc khử thuốc thử Folin – Ciocalteau phenol (phosphomolybdic-phosphotungstic acid) của tyrosine và dư lượng tryptophan trong protein, về bản chất là phosphomolybdic-phosphotungstic acid bị khử thành màu xanh do q trình oxy hóa của các axit amin thơm được xúc tác bởi đồng. Các phản ứng cho đến khi xuất hiện màu xanh đậm, phụ thuộc một phần vào hàm lượng tyrosine và tryptophan. Phương pháp này nhạy cảm với khoảng 0,01 mg protein/mL, và được sử dụng tốt nhất trên các dung dịch có nồng độ trong khoảng 0,01101 mg/mL protein (Waterborg, 2009).
Hóa chất:
Thuốc thử tạo phức: Chuẩn bị ngay trước khi sử dụng bằng cách trộn các dung dịch gốc sau theo tỷ lệ 100: 1: 1 (theo vol), tương ứng:
Dung dịch A: 2% (w/v) Na2CO3 trong nước cất. Dung dịch B: 1% (w/v) CuSO4.5H2O trong nước cất. Dung dịch C: 2% (w/v) natri kali tartrate trong nước cất. NaOH 2N.
Thuốc thử Folin 1 N.
Mẫu chuẩn: Sử dụng dung dịch protein albumin lịng trắng trứng có nồng độ 2 mg/mL trong nước cất, được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 20 ° C.
Quy trình:
Để 0,1 mL mẫu hoặc mẫu chuẩn, thêm 0,1 mL NaOH 2 N. Thủy phân ở 100 ° C trong 10 phút trong bể điều nhiệt. Làm nguội dịch thủy phân đến nhiệt độ phòng và thêm 1 mL thuốc thử tạo phức phức hợp mới. Để dung dịch ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Thêm 0,1 mL thuốc thử Folin, trộn đều hỗn hợp và để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Cuối cùng đọc độ hấp thụ ở 750nm. Từ kết quả thu được xác định hiệu suất cố định enzyme.