Giai đoạn tuổi n % 0-19 3 4,3 20-34 11 15,7 35-44 10 14,3 45-54 13 18,6 55-64 22 31,4 65-74 9 12,9 ≥ 75 2 2,9 Tổng 70 100 𝑋̅ ± SD (min - max) 49,6 ± 15,8 (5 - 78)
64
- Tuổi trung bình là 49,6 ± 15,8; trong đó tuổi thấp nhất là 5 tuổi, cao nhất là 78 tuổi.
- Có 22/70 bệnh nhân có độ tuổi từ 55 đến 64 tuổi, chiếm tỷ lệ cao nhất (31,4%); có 13/70 bệnh nhân tuổi từ 45 đến 54 cao thứ 2 (18,6%), tỷ lệ cao thứ ba là lứa tuổi từ 20 đến 34 tuổi, dưới 20 tuổi có 3 trường hợp chiếm 4,3%
trong đó có một trẻ 5 tuổi; thấp nhất là 2/70 (2,9%) bệnh nhân tuổi trên 75.
3.1.2. Đặc điểm về giới
Hình 3.1. Đặc điểm về giới của người bệnh trong nghiên cứu
- Có 64,3% là nam giới và 35,7% nữ giới.
- Tỉ lệ nam/nữ ≈ 1,8.
64,3% 35,7%
65
3.2. Kết quả xác định một số đột biến trên gen TP53, EGFR, FGFR ở người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu mô paraffin.
70 mẫu mô nghiên cứu được thực hiện tách DNA theo đúng quy trình, sau đó kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA bằng máy Nanodrop.
Hình 3.2. Hình ảnh minh họa kết quả đo OD của mẫu DNA tách chiết bằng máy Nanodrop 1000
Kết quả đo quang nồng độ DNA của 70 mẫu mơ, đều có nồng độ đạt >
25ng/µl và độ tinh sạch cao với tỷ số mật độ quang ở bước sóng 260/280 nm ln nằm trong khoảng 1,8-2,0.
Trước khi tiến hành giải trình tự gen, thơng thường cần có bước tinh sạch mẫu, để giảm tối đa các tạp chất trong mẫu, giảm ảnh hưởng kết quả, tránh phải giải lại gây tốn kém. Nếu bất kỳ mẫu nào có hình ảnh giải trình tự bị nhiễu, khơng đọc được kết quả, bắt buộc phải làm lại PCR của mẫu đó và giải trình tự lại đến khi thu được hình ảnh để đọc được [86].
Các mẫu có sản phẩm DNA sau nhân bản bằng PCR được tinh sạch và giải trình tự theo phương pháp giải trình tự trực tiếp bằng máy.
66
3.2.2. Một số hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân bản các exon nghiên
cứu của gen TP53, EGFR, FGFR
A)
B)
C)
D)
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân bản các exon nghiên cứu: A)
exon 7+8 gen TP53; B) exon 3 và C) exon 8 gen EGFR; D) exon 12 gen FGFR.
M: marker( kích thước các khoảng cách trên marker hơn kém nhau 100bp), (+): mẫu chứng dươngchứa DNA chuẩn, (-): mẫu chứng âm không chứa khuôn DNA. Các chữ số trên mỗi
giếng ký hiệu các mẫu nghiên cứu.
321 bp M G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 261 M GB1 5 8 10 20 21 26 38 40 43 44 M G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 261bp 617 bp
67
Kết quả trên cho thấy, mỗi mẫu điện di chỉ cho 1 băng sáng duy nhất, rõ nét, khơng có các băng phụ, kích thước đồng đều và có chiều dài tương ứng với kích thước tính tốn trên lý thuyết, marker được phân tách rõ ràng cho phép nhận định kết quả chính xác. Phản ứng PCR đạt hiệu quả, sản phẩm PCR thu được đặc hiệu, đạt yêu cầu cho kỹ thuật giải trình tự gen.
Các exon của các gen nghiên cứu của 70 mẫu bệnh, sau nhân bản đều đạt yêu cầu cho việc giải trình gen.
3.2.3. Kết quả giải trình tự gen xác định đột biến trên gen TP53
Sau khi kiểm tra chất lượng và tinh sạch, sản phẩm PCR được giải trình tự bằng máy giải trình tự gen tự động. Kết quả được phân tích trên phần mềm CLC Genomics Workbench.
* Kết quảđột biến vị trí p.R282W trên exon 8 gen TP53
A)
B)
Hình 3.4. Hình ảnhgiải trình tự đoạn exon 8 gen TP53 có chứa đột biến
điểm p.R282W
A) Mẫu đại diện có đột biến của bệnh nhân UNBTKĐmã số GB31. B) Mẫu đại diện khơng có đột biến của bệnh nhân UNBTKĐ mã số GB5
Kết quả giải trình tự rõ nét, các đỉnh tín hiệu rõ ràng, khơng bị nhiễu, tín hiệu nền thấp. Kết quả thu được tương ứng với kết quả giải trình tự khi so sánh với Gen-Bank.
Mẫu bệnh phẩm mã số GB31 có đột biến dị hợp tử thay thế nucleotid 846C>T dẫn đến ở vị trí codon thứ 282 bộ ba CGG mã hóa cho Arginine chuyển thành bộ ba TGG mã hóa cho Tryptophan, ký hiệu p.R282W.
68
* Kết quảđột biến vị trí p. R306X trên exon 8 gen TP53
A)
B)
Hình 3.5. Hình ảnhgiải trình tự đoạn exon 8 gen TP53 chứa đột biến điểm p.R306X
A) Mẫu đại diện có đột biến của bệnh nhân UNBTKĐ mã số GB11. B) Mẫu đại diện khơng có đột biến của bệnh nhân UNBTKĐ mã số GB8
Mẫu bệnh phẩm mã số GB11 có đột biến dị hợp tử thay thế nucleotid 916C>T dẫn đến ở vị trí codon thứ 306 bộ ba CGA mã hóa cho Arginine chuyển thành bộ ba TGA mã hóa cho Termination, ký hiệu p.R306X.
Các mẫu bệnh còn lại chưa phát hiện được đột biến nào trên exon 7 và exon 8 gen TP53.
3.2.4. Kết quả xác định đột biến trên gen EGFR
3.2.4.1. Kết quả giải trình tự xác định đột biến điểm trên gen EGFR
Sản phẩm PCR của các exon 2, exon 3, exon 7 và exon 8 sẽ được tiến hành giải trình tự để phát hiện đột biến điểm trên gen EGFR. Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench và so sánh với trình tự chuẩn của gen EGFR (NM_005228) trên ngân hàng dữ liệu Gene Bank.
Giải trình tự 70 mẫu bệnh phẩm của 70 bệnh nhân UNBTKĐ xác định đột biến điểm trên exon 2, exon 3, exon 7 và exon 8 của gen EGFR, kết quả được trình bày trong bảng 3.2.
69