Gen Exon Trình tự mồi Kích thước sản phẩm base pair (bp)
Hãng sản xuất TP53 7+8 Mồi xuôi 5′- GGTTGGGAGTAGATGGAGCC-3′
Mồi ngược 5′-ATGCCCCAATTGCAGGTAAA -3′ 495 IDT Mỹ
EGFR
2 Mồi xuôi5′- GG ACC TTG AGG GAT TGT TT-3′
Mồi ngược 5′- CTT CAA GTG GAA TTC TGC CC-3′ 312 IDT Mỹ
3 Mồi xuôi 5′- TTAGGGTTCAACTGGGCGTC-3′
Mồi ngược: 5′- AGCCTTCTCCGAGGTGGAAT-3′ 321 IDT Mỹ
7 Mồi xuôi 5′-GCT TTC TGA CGG GAG TCA AC-3′
Mồi ngược 5′-AGA CAG AGC GGG AAC AGG AT-3′ 296 IDT Mỹ
8 Mồi xuôi 5′-CT TCC ATC ACC CCT CAA GA-3′
Mồi ngược 5′-CTC AGC AGC CGA GAA CAA-3′ 261 IDT Mỹ
Bộ 10
exon Các mồi exon 2,3,4,5,6,7,8,13,16,23 trong 1 kit MRC
Hà Lan
FGFR
12 Mồi xuôi 5´-GCAGATGCATCCAGATGGTA-3´
Mồi ngược 5´-TCTCCATTCATGGCCACATA-3´ 617 IDT Mỹ
13 Mồi xuôi 5´-TGTGAAGAAGAACAAGCCTGC-3´
57
- Các cặp mồi sử dụng để nhân bản các exon trong xác định xóa đoạn gen ở dạng các đầu dò, được thiết kế để xác định số lượng bản sao các exon của gen EGFR và gen EGFRvIII trong bệnh UNBTKĐ: bao gồm các đầu dò xác định exon 1 (tên thăm dò MRC-Holland: 2062-L3282) exon 2 (5435-L4851), exon 3 (5436-L4852), exon 4 (5437-L4853), exon 5 (5438-L6027), exon 6 (6121- L6286), exon 7 (5440-L4856), exon 8 (2063-L3283), exon 13 (5441-L5612), exon 16 (2064-L1577) và exon 23 (5968-L5385). Kèm theo là 12 đầu dị tham khảo và bắt buộc phải có hình ảnh trên sản phẩm điện di trong các mẫu.
- Sử dụng quy trình kỹ thuật nhân bản DNA dò (MLPL), để xác định đột biến dạng EGFRvIII (phụ lục 4).
- Thực hiện theo đúng quy trình kỹ thuật PCR (phụ lục 2), để nhân bản các exon trên gen xác định đột biến điểm.
4/ Bước 4. Điện di sản phẩm PCR
* Điện di trên gel arogase:
- Mục đích: kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cho việc giải trình tự
- Yêu cầu: chạy điện di trên gel arogase, đảm bảo băng điện di rõ nét,
khơng có sản phẩm phụ, kích thước bằng với mẫu chuẩn [86].
- Nguyên tắc kỹ thuật: điện di là hiện tượng các phân tử mang điện dịch chuyển trong điện trường dưới tác dụng của dịng điện, phân tử tích điện âm di chuyển về cực (+) và phân tử tích điện dương dịch chuyển về cực (-).
Acid nucleic là phân tử mang điện tích âm nhờ khung phosphat của mình, dưới tác dụng của dịng điện một chiều acid nucleic sẽ di chuyển về cực dương. Các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển khác nhau. Tùy mục đích, có thể sử dụng các chất giá khác nhau để điện di DNA, phổ biến nhất là sử dụng gel agarose.
- Quy trình kỹ thuật: thực hiện theo đúngquy trình kỹ thuật (phụ lục 2) - Nếu chưa sử dụng cần lưu trữ, bảo quản sản phẩm PCR trong tủ âm (< 00C).
58
+ Điện di mao quản:
- Nguyên tắc kỹ thuật: điện di mao quản (CE - capillary electrophoresis) là
một kỹ thuật tách các chất trong dung dịch lỏng dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất (mang điện tích) trong cột mao quản dưới ảnh hưởng của điện trường tạo bởi điện áp cao thế (15 - 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản.
- Quy trình kỹ thuật: thực hiện đúng quy trình chạy điện di mao quản
(phụ lục 4).
Hình 2.1. Hình ảnh kết quả chạy điện di mao quản mẫu DNA chuẩn của
người nam (sử dụng bộ kit SALSA MLPA P105 của hãng hóa chất MRC-
Hà Lan sản xuất; hình ảnh do hãng hóa chất cung cấp)
+ Yêu cầu: hình ảnh điện di rõ, mẫu chuẩn chứa đủ 55 đỉnh tương ứng 55 đầu dò MLPA (đối với chuẩn nam), chứa 54 đỉnh (đối với chuẩn nữ): gồm các sản phẩm nhân bản từ 126 đến 500 nucleotid, 9 đoạn điều khiển tạo ra một sản phẩm nhân bản nhỏ hơn 120 nucleotid: bốn mảnh DNA (Q-fragments) tại vị
trí 64-70-76-82 nucleotid, ba đoạn điều khiển biến tính DNA (Dfragments) tại vị
59
105 nucleotid. Trong đó có 12 đỉnh tương ứng 12 đầu dị để kiểm sốt về độ nhạy và độ đặc hiệu (vị trí và kích thước/ nghĩa là các đỉnh này bắt buộc phải hiển thị trên hình ảnh điện di mao quản trong các mẫu).
- Kết quả điện di được đọc trên máy tính, đảm bảo đúng các tiêu chuẩn của phương pháp đo, các đỉnh điện di rõ nét, tất cả các đỉnh chuẩn phải rõ ràng, đạt kích thước cho phép.
5/ Bước 5. Giải trình tự với các cặp mồi tương ứng.
- Nguyên tắc kỹ thuật: giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các nuceotid trong phân tử DNA, dựa trên
nguyên tắc sử dụng các nucleotid tự do ddNTP do F.Sanger và cộng sự phát
minh [88]. Dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, qua hệ thống điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử
ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận diện được là nucleotid nào, từ đó biết được trình tự của DNA đích.
- Thực hiện theo đúngquy trình kỹ thuật giải trình tự (phụ lục 3).
- Kết quả giải trình tự đảm bảo rõ nét, các đỉnh nucleotid rõ, không đứt đoạn, khơng nhiễu.
6/ Bước 6. Phân tíchkết quả * Kết quả giải trình tự
- Đọc kết quả giải trình tự các exon và so sánh tương ứng với mẫu chuẩn trên Gen - Bank bằng phần mềm CLC Main Workbench 6.0.1.
- Trình tự nucleotid trên các exon được đọc bằng các tín hiệu huỳnh quang dựa trên nguyên tắc cảm quang, biểu hiện bằng trình tự các đỉnh sóng với mỗi loại nucleotid A, T, G, C lần lượt tương ứng với một màu khác nhau xanh lá, đỏ, đen, xanh dương. Bình thường mỗi vị trí nucleotid chỉ tương ứng 1
60
đỉnh sóng 1 màu, khi có sự biến đổi về nucleotid, sẽ xuất hiện 2 sóng trên cùng một vị trí hoặc mất hẳn sóng chính và thay bằng đỉnh sóng của một loại nucleotid khác. Kết quả của giải trình tự gen được thể hiện bằng hình ảnh là các đỉnh sóng liên tiếp nhau tương ứng với trình tự của các nucleotid trên exon. - Nếu mẫu nào không đạt (nhiễu, không đọc được kết quả), cần tinh sạch lại sản phẩm PCR và giải trình tự lại đến khi đọc được kết quả. Nếu vẫn không được cần làm lại PCR (bước 3), khơng được thì cần tách lại DNA (bước 2). Có thể chạy giải trình tự bằng mồi ngược nếu mồi xi kết quả vẫn khơng đọc được.
* Phân tích kết quả xóa đoạn dạng EGFRvIII
Phân tích kết quả bằng cơng cụ Coffalyser chun biệt (được cung cấp bởi hãng MRC - Hà lan).
Nguyên tắc: dựa vào số lượng các bản sao của các exon đã nhân bản được, để xác định có xóa đoạn EGFRvIII, cần tính trung bình cộng số lượng bản sao của các exon 2+3+4+5+6+7 chia cho trung bình cộng số lượng bản
sao của các exon 1+8+13+16+23 của gen EGFR (gọi là tỷ lệ EGFRvIII). Tỷ lệ EGFRvIII dưới 0,8 đã được coi là chứa biến thể xóa đoạn EGFRvIII.
2.3. Thời gian, địa điểmnghiên cứu
2.3.1. Thời gian nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu từ tháng 11/2015 đến tháng 12/2018.
2.3.2. Địa điểm nghiên cứu
- Bộ mơn Hóa sinh trường Đại học Y Hà Nội.
- Khoa Giải phẫu bệnh, Phòng Kế hoạch tổng hợp Bệnh viện Việt Đức. - Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội.
2.4. Xử lý số liệu
* Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê y học dựa vào phần mềm thống kê SPSS 19.0.
61
- Tất cả các số liệu được nhập vào máy tính, làm sạch số liệu.
- Sử dụng test đánh giá một số đặc điểm của đột biến gen trong bệnh UNBTKĐ. + Test T-student: các bảng có n > 5
+TestFisher Exact: các bảng có n ≤ 5
* Đọc kết quả giải trình tự bằng phần mềm CLC Main Workbench 6.0.1. * Phân tích kết quả xóa đoạn gen bằng công cụ Coffalyser chuyên biệt (được cung cấp bởi hãng MRC - Hà Lan).
2.5. Đạo đức trong nghiên cứu
Đề tài đã được thông qua hội đồng đạo đức của Trường Đại học Y Hà Nội, theo quyết định số 187/HĐĐĐĐHYHN tháng 2/2016.
- Mẫu vật nghiên cứu được lấy từ các mẫu mô sau mổ, hồn tồn khơng ảnh hưởng đến quá trình điều trị hay kết quả điều trị và đời sống sau này của người bệnh.
- Các mẫu được lấy có sự đồng ý của Ban Giám đốc bệnh viện, Phòng kế hoạch tổng hợp và Khoa Giải phẫu bệnh của bệnh viện Việt Đức.
- Tất cả các thông tin về người bệnh chỉ phục vụ công tác nghiên cứu và được giữ kín tuyệt đối.
- Người bệnh và người nhà khơng phải trả bất cứ kinh phí nào khi tham gia đề tài.
2.6. Biện pháp tránh sai số
- Sai số mẫu mơ
Cách khắc phục: tập huấn kỹ cho nhóm lấy mẫu, chọn mẫu đúng tiêu chuẩn chọn mẫu đã đề ra. Để tránh sai số do lấy khơng đúng phần mơ có các tế bào u, cần chọn phần mơ để tách DNA tại vùng có các tế bào u đang phát triển mạnh nhất trong tổ chức u, ít tổ chức hoại tử nhất có thể (nhận biết qua
soi tiêu bản cắt ngang vùng u đang phát triển mạnh), theo tiêu chuẩn lấy mẫu mô đúc paraffin của Bệnh viện Việt Đức.
62
- Nồng độ DNA thấp, độ tinh sạch không đạt chuẩn
Cách khắc phục: tách chiết lại đến khi đạt tiêu chuẩn.
- Sai quy trình kỹ thuật
Cách khắc phục: các qui trình kỹ thuật thực hiện trong nghiên cứu cần chuẩn hóa trước. Khi thực hiện kỹ thuật PCR: đảm bảo mỗi lần chạy mẫu cần chạy kèm 1 chứng âm (lấy nước cất làm mẫu), và kèm 1 chứng dương (là mẫu đã được chuẩn hóa, giải trình tự và đã được đọc kết quả sau so sánh với trình tự chuẩn trên gen bank, đảm bảo chính xác là trình tự của các exon tương ứng
trên gen).
- Sai kết quả giải trình tự: do tinh sạch mẫu chưa tốt gây nhiễu kết quả.
Cách khắc phục: thực hiện kỹ thuật giải trình tự cần lưu ý bước tinh sạch mẫu, nếu sau giải trình tự bị nhiễu khơng đọc được cần tinh sạch lại và giải trình tự lại cho đến khi đọc được kết quả, trình tự mẫu giải được phải tương ứng trình tự mẫu trên Gen Banks.
- Sai thông tin nghiên cứu
Cách khắc phục: ghi chép đầy đủ thông tin lấy từ bệnh án theo mẫu phiếu đã thống nhất cho tất cả người bệnh. Các thông tin qua gọi điện phải hỏi người thân cận nhất của người bệnh như: vợ, chồng, con, bố mẹ … về các đặc điểm thời gian sống chết, tiền sử phẫu thuật lần trước, thời gian điều trị xạ trị, hóa chất sau phẫu thuậtvà ghi chép đầy đủ.
2.7. Kinh phí thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ một phần kinh phí của đề tài:
“Nghiên cứu xác định đột biến một số gen trong bệnh U nguyên bào thần
kinh đệm” thuộc đề tài cấp Bộ Y tế năm 2014, quyết định số 4214/QĐ-BYT
63
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Qua nghiên cứu xác định tình trạng đột biến gen TP53, EGFR, FGFR ở 70 mẫu mô của 70 người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm sau phẫu thuật tại bệnh viện Việt Đức, chúng tôi thu được kết quả như sau:
3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu
3.1.1. Đặc điểm về tuổi
Chúng tôi chia tuổi theo cách chia các giai đoạn tuổi của tổ chức CBTRUS Hoa kỳ [4].