Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.4. Phân tích NST ở các nam giới vô tinh và thiểu tinh nặng
* Bước 1: Nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phương pháp của Hungerford D. A. [151].
- Lấy 5 ml máu tĩnh mạch cho vào tuýp vô trùng đã được tráng bằng heparin.
- Nhỏ 4 ml máu toàn phần vào tuýp nuôi cấy. Môi trường ni cấy là Karyotyping Medium của Gibco®.
- Đặt các tuýp nuôi cấy trong tủ ấm 370C thời gian 72 giờ. Trước khi thu hoạch 2 giờ, nhỏ dung dịch colcemid vào môi trường để dừng các tế bào ở kỳ giữa. Thu hoạch giờ thứ 72.
* Bước 2: Thu hoạch tế bào [152]
- Dịch treo tế bào từ tuýp nuôi cấy được chuyển sang ống ly tâm, ly tâm với tốc độ 800 - 1000 vòng/phút, thời gian 10 phút.
- Sau khi ly tâm loại bỏ dịch nổi ở phía trên, để lại phần cặn tế bào, nhược trương bằng dung dịch KCl, nồng độ 0,075 M. Để trong tủ ấm 370
C, thời gian 45 phút để phá vỡ màng tế bào.
- Định hình NST bằng dung dịch Carnoy với tỷ lệ 3 methanol: 1 acid acetic, để vào tủ lạnh 30 phút, ly tâm 1000 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi, giữ lại cặn tế bào. Bước định hình NST được lặp lại 3 lần.
- Lần cuối cùng sau khi ly tâm loại bỏ dịch nổi phía trên, dùng ống hút nhỏ giọt hút lấy phần cặn chứa nhân tế bào, trong đó có các cụm kỳ giữa rồi dàn đều lên phiến kính sạch đã được để lạnh.
* Bước 3: Nhuộm tiêu bản [152],[153]
- Dàn đều tế bào lên tiêu bản, để tiêu bản khô tự nhiên.
- Tiêu bản NST được nhuộm bằng phương pháp nhuộm băng G [153]. * Bước 4: Phương pháp phân tích NST và lập karyotyp theo tiêu chuẩn ISCN (2005) [154].
- Quan sát NST dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Tìm các tế bào ở kỳ giữa có các NST dàn đều để đếm số lượng NST trong tế bào đó. Trung bình cho mỗi mẫu phải đánh giá ít nhất 30 cụm kỳ giữa, trong trường hợp cần thiết phải phân tích 100 cụm kỳ giữa (những trường hợp nghi là thể khảm).
- Phát hiện và phân tích các rối loạn cấu trúc NST khi đếm số lượng. - Phân tích NST và lập karyotyp theo tiêu chuẩn ISCN với hệ thống karyotyping bằng phần mềm Ikaros.
Tổng hợp các số liệu đánh giá rồi kết luận về số lượng và hình thái cấu trúc NST sau khi đã lập karyotyp của đối tượng nghiên cứu.