Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. MỘT Sễ́ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI KHUẨN TRONG VIấM
1.4.3. Cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử
Những xột nghiệm sinh học phõn tử giỳp chẩn đoỏn một cỏch chắc chắn cỏc vi khuẩn gõy bệnh VQR, giỳp bỏc sĩđưa ra kế hoạch điều trị phự hợp nhất
để giảm chi phớ và thời gian điều trị, giảm những biến chứng của bệnh VQR.
PCR là một kỹ thuật rất nhanh, nhạy và đặc hiệu cho phộp xỏc định nhanh và
chớnh xỏc DNA của vi khuẩn trong vài giờ. Trờn thế giới hiện nay, chẩn đoỏn xỏc định bệnh VQR bằng cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử để phỏt hiện sự cú mặt của vi khuẩn A. actinomycetemcomitans và P. gingivalis cựng cỏc gen độc tố gõy bệnh khỏc nhau của chỳng đó được triển khai khỏ rộng rói, cỏc nghiờn cứu đều cho thấy cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử cú độ nhạy hơn rất nhiều so với kỹ thuật nuụi cấy cổ điển [8],[24],[59],[60]. Nghiờn cứu của Doungugomdacha (2000) trờn 12 mẫu mảng bỏm răng của cỏc bệnh nhõn
VQR mạn tớnh sử dụng kỹ thuật PCR đó phỏt hiện được vi khuẩn P. gingivalis trong 6 mẫu bệnh phẩm, song song bằng kỹ thuật nuụi cấy P. gingivalis dương tớnh trờn 1 mẫu bệnh phẩm [61].
Kỹ thuật real-time PCR là kỹ thuật PCR mà sản phẩm khuếch đại DNA đớch hiển thị cựng lỳc mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, nờn được gọi là PCR
thời gian thực [59],[60]. Realtime PCR định lượng được DNA đớch nờn cũn gọi là PCR định lượng (qPCR). Verner và c.s. (2006) nhận định qPCR nhạy hơn kỹ thuật nuụi cấy [62]. Tỉ lệ vi khuẩn phỏt hiện bằng real-time PCR cao
hơn kỹ thuật nuụi cấy, mức độ chờnh lệch trong định lượng DNA giữa kỹ thuật realtime PCR với kỹ thuật nuụi cấy lần lượt là 51,4% đối với P. gingivalis, 36,1% đối với T. forsythensis, 12,5% đối với F. nucleatum, 8,3%
đối với P. intermedia, 3% đối với A. actinomycetemcomitans [62].
Cú hai cỏch định lượng DNA đớch: định lượng tuyệt đối và định lượng tương đối [59],[60].
- Định lượng tuyệt đối: kỹ thuật định lượng này đũi hỏi phải biết rừ về thể tớch hay trọng lượng của mẫu bệnh phẩm. Người thực hiện xột nghiệm
realtime PCR phải tiến hành trờn mẫu bệnh phẩm cựng với cỏc mẫu chuẩn đó biết trước số lượng rồi tớnh ra số copies của DNA đớch cú trong ống phản ứng dựa vào đường biểu diễn chuẩn xỏc định mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng
(Ct) với số lượng copies DNA ban đầu cú trong ống phản ứng. Cuối cựng,
việc xỏc định số copies của DNA đớch cú trong mẫu bệnh phẩm dựa vào hệ số pha loóng mẫu hay hệ số tỏch chiết DNA của kỹ thuật chuẩn bị mẫu trước khi thực hiện realtime PCR.
- Định lượng tương đối: kỹ thuậtđịnh lượng này khụng đũi hỏi phải biết rừ về thể tớch hay trọng lượng của mẫu bệnh phẩm, thụng số định lượng là chu kỳ ngưỡng (Ct) [60].
Vớ dụ: kỹ thuật realtime PCR định lượng tương đối cho kết quả tỉ lệ
A. actinomycetemcomitans hay P. gingivalis trờn tổng số cỏc vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm, được tớnh theo phương phỏpso sỏnh chu kỳ ngưỡng [6]:
Ct của cỏc vi khuẩn 16S rDNA
Theo cụng thức trờn, khi chu kỳ ngưỡng (Ct) phỏt hiện P. gingivalis
càng thấp, tỉ lệ P. gingivalis càng tăng thỡ số lượng P. gingivalis trong bệnh
phẩm càng nhiều bởisố lượng P. gingivalis càng nhiều thỡ cần càng ớt chu kỳ nhiệt khuếchđại hơn.
Kỹ thuật PCR cú thể phỏt hiện bất cứ loại vi khuẩn nào, kể cả khi vi khuẩn khụng cũn sống hoặc khi bệnh nhõn đó sử dụng khỏng sinh trước khi
làm xột nghiệm. Định lượng vi khuẩn khụng chỉ giỳp ớch trong chẩn đoỏn bệnh VQR mà cũn giỳp đỏnh giỏ hiệu quả điều trị, theo dừi sự tiến triển của bệnh.
Ct của P. gingivalis