CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1 Bệnh lao, lao đồng nhiễm HIV
1.5. Chẩn đoán vi khuẩn lao bằng các kỹ thuật sinh học phân tử
Với sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử nói chung, các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đốn lao có rất nhiều hứa hẹn khi trên phương diện lý thuyết có thể phát hiện ra vật chất di truyền của một vài vi khuẩn trong điều kiện phịng xét nghiệm, điều này đặc biệt có ý nghĩa với các thể lao soi đờm trực tiếp âm tính, lao ở người nhiễm HIV, lao trẻ em, hoặc phát hiện sớm lao đa kháng thuốc.
1.5.1. Phản ứng chuỗi PCR (polymerase chain reaction) phát hiện vi khuẩn lao
PCR là phản ứng chuỗi trùng hợp DNA nhân tạo dựa trên cơ sở sự bắt cặp đặc hiệu của hai sợi đơn nucleotide được thiết kế theo nguyên lý bổ sung với đoạn gen đặc hiệu cần phân tích. Ứng dụng trong chẩn đốn vi khuẩn lao dựa trên việc phát hiện đoạn gen IS 6110. Trong điều kiện phòng xét nghiệm chỉ cần một lượng nhỏ vi khuẩn (1-3 vi khuẩn/1mm3 bệnh phẩm) đã cho kết quả dương tính. PCR khơng cho biết vi khuẩn cịn sống hay đã chết. Tỷ lệ dương tính giả cao do lây nhiễm trong quy trình kỹ thuật. Âm tính giả có thể do sự có mặt của nhiều chất ức chế men nhân bản gen trong bệnh phẩm hoặc những vi khuẩn có dưới 6 đoạn IS 6110 hoặc khơng có đoạn này [51],[53]. Noordhoek (1994) tổng hợp kết quả từ 7 phòng xét nghiệm khác nhau, nhận xét độ nhạy của PCR trong chẩn đốn lao, dương tính giả cao từ 43%-77%, nguy cơ lây nhiễm chéo rất cao [52].
1.5.2. Kỹ thuật LPA (Line-Probe Assay)
Kỹ thuật này liên quan tới các bước như chiết tách DNA của vi khuẩn lao từ bệnh phẩm lâm sàng trực tiếp hoặc từ vi khuẩn lao được phân lập, thực hiên quá trình nhân bản các đoạn acid nhân, lai ghép, sử dụng chất nhuộm huỳnh quang (SYBR Green), sử dụng các mẫu dị có khả năng phát huỳnh quang khi lai với một mạch DNA bổ sung, dựa trên các đầu dò phát hiện mức độ phát quang trong mơi trường xét nghiệm để tính tốn số bản lai được nhân lên [51],[52].
Thế hệ LPA thứ nhất, INNO LiPA Rif TB (Innogenetics NV): INNO Lipa được thực hiện dựa trên nguyên tắc lai ghép ngược đoạn DNA khuyếch đại từ chủng ni cấy hoặc bệnh phẩm với 10 đoạn dị (probe) phủ vùng nhân của gen rpoB của M. tuberculosis. Từ các kiểu lai ghép thu được có thể nhận biết sự thiếu hụt hoặc sự xuất hiện của vùng đột biến liên quan đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao, từ đó có thể kết luận chủng đó kháng hay nhạy với RMP. Viveiros (2005) nghiên cứu giá trị của NNO-LiPA Rif TB trên 360 bệnh phẩm soi trực tiếp dương tính từ quần thể có tỷ lệ đa kháng thuốc cao, độ nhạy so với phương phát chuẩn phát hiện vi khuẩn lao Se 82,2%, đặc hiệu Sp 66,7%; độ nhạy phát hiện kháng RMP Se 100,0% đặc hiệu Sp 96,9%. Tuy nhiên vẫn xuất hiện âm tính giả khi có yếu tố ức chế quá trình nhân bản trong bệnh phẩm, khơng có chứng nội tại, không phân biệt được DNA từ xác vi khuẩn ở bệnh nhân đang điều trị [54].
Thế hệ LPA thứ hai, GenoType MTBDRplus (Hain Lifesciene): được phát triển trên công nghệ DNA-STRIP phát hiện kháng RMP và INH vi khuẩn lao. Xác định được tính kháng của RMP qua các đột biến quan trọng của gen rpoB (mã hoá cho tiểu phần β của RNA polymerase), kháng INH ở mức độ cao độ liên quan đột biến gen katG (mã hoá cho enzyme catalase - peroxidase), kháng INH ở mức độ thấp liên quan đột biến gen inhA. Lacoma (2008) nghiên cứu kỹ thuật GenoType MTBDRplus (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany) khả năng phát hiện kháng RMP và INH trên 62 chủng lâm sàng so sánh với hệ thống Bactec 460TB, độ nhạy phát hiện RMP Se 98,3% (61/62), độ nhạy phát hiện INH Se79% (49/62), 27 chủng có mức độ kháng INH thấp độ nhạy Se 62,9% (17/27), 21 chủng độ kháng INH cao độ nhạy Se 85,71% (18/21). Độ nhạy phát hiện kháng RMP 98% (50/51), kháng INH 96,2% (49/51) [55]. Nguyễn Thu Hà (2013) nghiên cứu kỹ thuật Genotype MTBDRplus thấy xét nghiệm chẩn đoán kháng RMP độ nhạy, đặc
hiệu lần lượt là (Se 91,8%; Sp 100%) cao hơn kháng INH (Se 88,5%; Sp 93,8%), cao hơn đa kháng thuốc (Se 76,8%; Sp 100%) [56].
Kỹ thuật nhân bản đẳng nhiệt vòng trung gian (LAMP; Loop-Mediated Isothermal Ampllification): kỹ thuật dựa trên giả thuyết là acid nhân khi được nhân bản lên đủ số lượng nhất định sẽ có thể quan sát được dưới nguồn sáng huỳnh quang. Kỹ thuật còn đang trong giai đoạn thử nghiệm ban đầu, cho thấy có độnhạy cao với những bệnh phẩm soi trực tiếp dương tính và độ nhạy thấp với bệnh phẩm soi trực tiếp âm tính [57].
Kỹ thuật Oligonucleotide Microarray: kỹ thuật cho phép phát hiện đồng thời nhiều đột biến gen, có thể phát hiện các gen đột biến liên quan tới kháng thuốc của một chủng vi khuẩn. TB-Biochip (Englhardt Institure of Molecular Biology) phát hiện kháng RMP của M.tuberculosis. Độ nhạy khoảng 80% [57]. Một số ưu điểm chung của các kỹ thuật sinh học phân tử như: thời gian cho kết quả nhanh, yêu cầu trang thiết bị cơ sở, đào tạo nhân lực dễ dàng hơn so với các kỹ thuật truyền thống, độ chính xác cao, thực hiện được trên khối lượng lớn cơng việc qua đó giảm giá thành xét nghiệm. Tuy nhiên sinh học phân tử có một số điểm hạn chế chung: không xác định được vi khuẩn sống hay chết, yêu cầu cao về cung cấp nguồn nước nguồn điện, độ chính xác cao với các bệnh phẩm soi trực tiếp dương tính, khơng cao với bệnh phẩm soi âm tính do đó hạn chế ở những nơi có tỷ lệ bệnh nhân nhiễm HIV [51],[53],[55],[57].