CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Các kỹ thuật thực hiện trong nghiên cứu
2.3.2.1. Kỹ thuật chọn mẫu
Tất cả các bệnh nhân nhập viện do đợt cấp đáp ứng được tiêu chuẩn lựa chọn đều được đưa vào nghiên cứu. Các bệnh nhân này được khám và thu thập các chỉ tiêu lâm sàng, xét nghiệm cận lâm sàng và lấy mẫu huyết thanh lưu trữ phục vụ xét nghiệm định lượng nồng độ các Ig huyết thanh.
Các bệnh nhân được điều trị đợt cấp theo phác đồ của “Hướng dẫn
quốc gia xử trí hen và bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính” [7]. Theo dõi đánh giá
diễn biến và kết cục điều trị . Đánh giá lại triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm cận lâm sàng và lấy mẫu huyết thanh định lượng nồng độ các Ig lần 2 khi ổn định đợt cấp, trước khi xuất viện.
Các bệnh nhân tử vong trong đợt cấp được phân tích về đặc điểm triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng và nồng độ Ig huyết thanh tại thời điểm nhập viện do đợt cấp để làm cơ sở đánh giá tiên lượng tử vong.
2.3.2.2. Thu thập thông tin lâm sàng và cận lâm sàng
Khám lâm sàng: Nghiên cứu sinh trực tiếp khám bệnh cùng với bác sỹ
phụ trách buồng bệnh và theo dõi diễn biến đến khi kết thúc điều trị nội trú. Lập mẫu bệnh án nghiên cứu theo một mẫu thống nhất để thu thập các thông tin nghiên cứu.
Nhóm bệnh nhân khơng tử vong: Thu thập thông tin lâm sàng và cận lâm sàng, định lượng nồng độ các Ig huyết thanh tại hai thời điểm: khi nhập viện trong đợt cấp và sau khi điều trị ổn định đợt cấp
Nhóm bệnh nhân tử vong: Thu thập thông tin lâm sàng và cận lâm sàng, định lượng nồng độ Ig huyết thanh ở thời điểm nhập viện và trước tử vong do đợt cấp.
Chụp Xquang phổi chuẩn: Bệnh nhân được chụp Xquang phổi khi nhập viện bằng máy Xquang kỹ thuật số, tại Khoa chẩn đoán hình ảnh, Bệnh viện quân y 103. Kết quả được đánh giá bởi bác sỹ chẩn đốn hình ảnh và thầy hướng dẫn. Đọc phim Xquang theo tiêu chuẩn thống nhất [19].
Cấy khuẩn đờm: mẫu bệnh phẩm đờm được lấy trong vòng 24 giờ đầu
sau khi nhập viện. Mẫu cấy có mọc vi khuẩn gây bênh sẽ được thực hiện kháng sinh đồ giúp hướng dẫn lựa chọn phác đồ kháng sinh điều trị phù hợp.
Đo hô hấp ký: Thời điểm thực hiện đo là sau khi bệnh nhân đã được
điều trị ổn định đợt cấp. Ở nhóm bệnh nhân tử vong, khơng thể đo được hơ hấp ký thì sử dụng kết quả hô hấp ký của lần đo gần nhất trong vịng 12 tháng. Kết quả hơ hấp ký được sử dụng làm tiêu chuẩn chuẩn đoán BPTNMT. Kỹ thuật đo theo quy trình kỹ thuật của Bộ y tế [74].
- Phương tiện kỹ thuật: máy phế dung kế Minispir A23 (Hoa Kỳ) có kết nối máy tính xách tay cài đặt phần mềm WinspiroPro. Đo tại Trung tâm hô hấp - BVQY103. Do nghiên cứu sinh và kỹ thuật viên thực hiện, có bác sỹ chuyên khoa giám sát.
- Kỹ thuật đo: Thực hiện đo hô hấp ký khi ổn định đợt cấp, trước khi đo bệnh nhân khơng hít thuốc giãn phế quản tác dụng ngắn trong 6 giờ, thuốc cường beta 2 tác dụng kéo dài trong 12 giờ, thuốc tiotropium 48 giờ hoặc theophylin dạng phóng thích chậm trong 24 giờ.
Giải thích cho bệnh nhân mục đích ý nghĩa việc đo thông khí phổi, nhập họ tên, tuổi, giới, cân nặng và thông tin cá nhân của bệnh nhân vào phần mềm máy tính. Hướng dẫn qui trình đo và làm mẫu cho bệnh nhân quan sát.
Bệnh nhân được kẹp kín 2 lỗ mũi, ngậm kín ống thở, thở qua mồm, hít vào và thở ra bình thường khoảng 3 chu kỳ hơ hấp sau đó hít vào từ từ, thật gắng sức rồi thở ra nhanh mạnh, liên tục hết sức tối thiểu 6 giây. Nghỉ 2-3 phút rồi đo lại. Đo 3 lần phải đạt kết quả ở bản ghi đúng kỹ thuật. Lấy bản kết quả có giá trị tốt nhất theo tiêu chuẩn ATS. Làm test phục hồi phế quản: xịt
400µg salbutamol, sau 15 phút đo lại. Nếu FEV1 sau test không tăng hoặc tăng dưới 12 % hoặc dưới 200ml thì được gọi là test phục hồi phế quản âm tính. Bản kết quả được chọn là kết quả đo sau test. Kết quả được đọc bởi bác sỹ chuyên khoa chẩn đoán chức năng và thầy hướng dẫn.
Hình 2.1. Đo hơ hấp ký cho đối tượng nghiên cứu
Xét nghiệm sinh hóa, huyết học, miễn dịch: thực hiện xét nghiệm tại
2 thời điểm, khi bệnh nhân nhập viện và sau khi ổn định đợt cấp.
- Xét nghiệm công thức máu: Lấy 2ml máu tĩnh mạch bảo quản trong ống chống đông ETA, xét nghiệm tại khoa Huyết học - BVQY 103. Các chỉ số đánh giá: số lượng hồng cầu, huyết sắc tố, hematocrit, số lượng và công thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu.
- Xét nghiệm sinh hóa máu: Lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống chống đơng Heparin, làm xét nghiệm tại khoa Sinh hóa - BVQY 103. Các chỉ tiêu đánh giá: Glucose, Ure, Creatinin, AST, ALT, CRP, điện giải đồ
- Xét nghiệm các dấu ấn viêm: Lấy máu tĩnh mạch xét nghiệm tại 2 thời điểm là trong vòng 24h sau khi nhập viện và trước thời điểm xuất viện. Các xét nghiệm được thực hiện tại khoa Sinh hóa - BVQY103.
+ Định lượng nồng độ CRP: Định lượng nồng độ CRP bằng phương pháp miễn dịch đo độ đục siêu nhậy. Nồng độ CRP được biểu thị bằng đơn vị mg/L. Giới hạn phát hiện thấp nhất của xét nghiệm này là < 0,10mg/L. Nguyên tắc: CRP trong huyết thanh sẽ kết hợp với kháng CRP có sẵn trong dung dịch của thuốc thử. Phức hợp kháng nguyên-kháng thể CRP làm dung dịch thử trở nên đục. Độ đục này thay đổi tuỳ theo nồng độ CRP có trong mẫu huyết thanh. Đo độ đục bằng máy quang phổ và quy đổi ra giá trị mg/L. Ở người khỏe mạnh, nồng độ trung bình CRP trong máu < 1mg/l.
+ Định lượng nồng độ PCT: Sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang, đơn vị tính ng/ml. Giá trị bình thường: PCT < 0,05 ng/ml.
Xét nghiệm khí máu động mạch: thực hiện tại 2 thời điểm, khi bệnh
nhân nhập viện và sau khi ổn định đợt cấp. Với các bệnh nhân nặng, xét nghiệm kiểm tra theo chỉ định điều trị vẫn được thực hiện.
Nguyên lý xét nghiệm: Theo nguyên lý điện cực chọn lọc.
- Gồm 1 điện cực chuẩn và các điện cực: điện cực PaO2, điện cực PaCO2, điện cực pH
- Điện cực đo pH: Khi mẫu bệnh phẩm đi qua điện cực thì ở bề mặt giữa điện cực và bệnh phẩm phát sinh điện thế mà trị số phụ thuộc vào nồng độ ion H+ trong mẫu bệnh phẩm.
- Điện cực đo áp suất riêng phần của carbonic trong máu động mạch (PaCO2): khi CO2 thấm qua một màng silicol đặc hiệu sẽ tiếp xúc với dung dịch bicarbonat và làm thay đổi pH của dung dịch này, kết quả biểu thị ra PaCO2.
- Điện cực đo áp suất riêng phần của oxy trong máu động mạch (PaO2): là điện cực platin được âm cực hóa, oxy thấm qua màng sẽ khử cực một phần bề mặt của catot và làm giảm điện trở của mạch điện. Cường độ dòng điện đo được tỷ lệ thuận với nồng độ oxy của dung dịch.
- Từ ba thông số được đo trực tiếp trên, máy tính tốn ra các thơng số khác như: nồng độ HCO3-, kiềm dư (BE), kiềm đệm (BB),…là những thông số cần thiết để đánh giá trạng thái toan - kiềm.
Quy trình thực hiện: theo quy trình kỹ thuật của Bộ y tế [75].
- Lấy 1ml máu động mạch quay vào bơm tiêm có chống đơng Heparin. Mẫu máu sau khi lấy xong được chuyển ngay xuống để thực hiện xét nghiệm.
- Thực hiện xét nghiệm khí máu tại khoa Sinh hóa – BVQY103 ngày sau khi lấy mẫu bằng hệ thống máy xét nghiệm khí máu GEM primer 3000 ( Hoa Kỳ). Khảo sát các chỉ số: áp lực riêng phần oxy (PaO2), áp lực riêng phần carbonic (PaCO2), độ bão hòa Oxy (SaO2), pH máu, bicarbonat (HCO3-), nồng độ kiềm dư (BE), nồng độ bicarbonat (HCO3-), nồng độ kiềm dư (BE).
Phương pháp xét nghiệm định lượng nồng độ các Ig huyết thanh:
mẫu huyết thanh được lấy và lưu trữ tại 2 thời điểm, khi bệnh nhân nhập viện trong đợt cấp và sau khi ổn định đợt cấp. Xét nghiệm định lượng nồng độ các Ig huyết thanh được tiến hành tại Bộ môn Miễn dịch, Học viện quân y bằng bộ kit Introgen (Áo). Xét nghiệm thực hiện theo quy trình chuẩn của nhà sản xuất (Thermo Fisher Scientific Inc) [76].
Lấy 3ml máu vào ống nghiệm không chống đông tại thời điểm trong vòng 24h khi bệnh nhân nhập viện và sau khi bệnh nhân ổn định đợt cấp trước xuất viện 24h, được chuyển ngay về labo trước 2 tiếng đồng hồ kể từ khi lấy máu. Sau đó tiến hành ly tâm các mẫu máu với tốc độ 1500 vòng/phút để tách huyết thanh và bảo quản lưu mẫu ở tủ âm -800C. Khi thu thập đủ mẫu, chuẩn bị các kit và hóa chất, tiến hành giã đông bệnh phẩm và tiến hành xét nghiệm.
Nguyên lý phản ứng phát hiện Ig
Các globulin (Ig) miễn dịch được phát hiện bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang kiểu sandwich trên bề mặt của các vi hạt từ. Bề mặt của vi hạt được gắn sẵn các phân tử kháng thể đơn clon đặc hiệu với quyết định kháng nguyên trên phân tử Ig. Khi ủ mẫu xét nghiệm với hạt phủ kháng thể, các
phân tử Ig sẽ bị kháng thể đặc hiệu bắt giữ và bám vào bề mặt hạt. Sau đó kháng thể đơn clon thứ hai đặc hiệu với một quyết định kháng nguyên khác của Ig đã gắn biotin được thêm vào, tạo thành phức hợp miễn dịch gồm phân tử Ig kẹp giữa hai kháng thể đơn clôn. Cuối cùng phức hợp streptavidin-PE được thêm vào sẽ gắn vào kháng thể đơn clon thứ hai qua tương tác streptavidin-biotin. Dước tác động của tia laser bước sóng tử ngoại PE sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang chứng tỏ sự có mặt của Ig trong mẫu xét nghiệm. Lượng PE gắn vào tỷ lệ thuận với lượng kháng thể thứ hai hay lượng Ig có trên bề mặt hạt từ. Dựa vào mật độ huỳnh quang phát ra từ các hạt được ủ với những nồng độ Ig đã biết cho phép định lượng được các lớp Ig khác nhau.
Qui trình xét nghiệm
- Bước 1: chia đều 50 l hỗn hợp các hạt từ đã gắn kháng thể vào các giếng của một microplate 96 giếng.
- Bước 2: cho 50 l mẫu globulin miễn dịch chuẩn đã pha loãng bậc ba với nồng độ khác nhau đã biết của 2 lọ chất chuẩn vào các giếng và ủ trong điều kiện lắc nhẹ bằng máy lắc trong 120 phút tại nhiệt độ phòng. Rửa 3 lần để loại bỏ các thành phần không bám vào hạt bằng phương pháp lọc qua màng lọc với máy hút chân không.
- Bước 3: cho 25 l hỗn hợp kháng thể đơn clôn đặc hiệu với các Ig tương ứng cần phát hiện đã gắn biotin vào và ủ tiếp trong điều kiện như trên trong 30 phút để hình thành phức hợp miễn dịch kiểu sanhdwich. Rửa 3 lần theo như mô tả ở bước 2.
- Bước 4: cho 50 l dung dịch streptavidin-PE vào và ủ trong 30 phút cho gắn vào phức hợp miễn dịch thông qua tương tác biotin-treptavidin. Rửa 3 lần theo như mô tả ở bước 2 để loại bỏ các phức hợp streptavidin-PE tự do,
- Bước 5: cho 120 l dung dịch rửa vào mỗi giếng sau đó đọc và phân tích kết quả bằng hệ thống Luminex 200 ở chế độ chọn độ chọn tốc độ dòng chảy (60 l/phút) và thể tích mẫu đọc là 50 l.
Kết quả nồng độ các Ig huyết thanh thể hiện bằng đơn vị mg/dl.
Hình 2.2. Thực hiện xét nghiệm định lượng nồng độ các Ig huyết thanh tại Bộ môn Miễn dịch – Học viện quân y
2.3.2.3. Điều trị đợt cấp
Tất cả bệnh nhân nhập viện được điều trị theo hướng dẫn xử trí đợt cấp bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính trong “Hướng dẫn quốc gia về xử trí hen và bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (2015)” [7].
- Điều trị thuốc: bao gồm thuốc dãn phế quản, kháng sinh và corticoid
- Điều trị hỗ trợ hô hấp:
+ Oxy liệu pháp: bệnh nhân được thở hỗ trợ oxy để đảm bảo duy trì độ bão hịa oxy với mức SpO2 ≥ 90%.
+ Thơng khí cơ học khơng xâm nhập khi có các triệu chứng sau: Khí máu động mạch có nhiễm toan hơ hấp; Khó thở nặng với biểu hiện mệt cơ hô hấp, thở gắng sức. Tri giác còn tỉnh táo và huyết động còn ổn định.
+ Thơng khí cơ học xâm nhập khi có một trong các triệu chứng sau: Thất bại với thông khí khơng xâm nhập; Rối loạn huyết động nặng; Rối loạn tri giác cấp tính;
- Điều trị các bệnh lý đồng mắc với sự phối hợp của các chuyên khoa và chăm sóc dinh dưỡng, vật lý trị liệu hơ hấp hỗ trợ.
2.3.2.3. Phương pháp xác định giá trị tiên lượng tử vong trong đợt cấp của các yếu tố lâm sàng và cận lâm sàng:
- Đánh giá kết quả điều trị đợt cấp: chia đối tượng nghiên cứu thành 2 nhóm tử vong và khơng tử vong.
- Phân tích giá trị các yếu tố lâm sàng, cận lâm sàng tiên lượng tử vong trong đợt cấp.
- Phân tích hồi quy đơn biến: Tiến hành phân tích hồi quy đơn biến tất cả các biến số lâm sàng và cận lâm sàng có liên quan đến nguy cơ tử vong trong đợt cấp được ghi nhận để tìm các yếu tố ảnh hưởng có ý nghĩa đến nguy cơ tử vong của bệnh nhân trong đợt cấp.
- Phân tích hồi quy đa biến: Thực hiện phân tích đa biến với các yếu tố ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê đến nguy cơ tử vong ở phân tích đơn biến để xác định các yếu tố thực sự có giá trị tiên lượng độc lập tử vong đợt cấp.
- Xác định giá trị tiên lượng tử vong của tổ hợp các yếu tố có giá trị: + Từ phân tích đa biến, chúng tơi chọn được 5 yếu tố lâm sàng và cận lâm sàng có giá trị tiên lượng độc lập tử vong gồm: rối loạn ý thức (Confusion: C), khó thở nặng (Dyspnea: D), toan hóa máu (Acidosis: A), tăng PCT máu (Procalcitonin: P) và viêm phổi (Pneumonia).
+ Để thuận lợi trong cách sử dụng chúng tơi cho mỗi yếu tố được tính tương ứng 1 điểm và tổng điểm tối đa của tổ hợp thang điểm CDAPP là 5.
Bảng 2.2. Thang điểm CDAPP
Các yếu tố Điểm
Có Khơng
Rối loạn ý thức (Confusion: C) 1 0
Khó thở nặng (Dyspnea: D) 1 0
Toan hóa máu (Acidosis: A) 1 0
Tăng PCT máu (Procalcitonin: P) 1 0
Viêm phổi (Pneumonia: P) 1 0
Tổng điểm 5
+ Kiểm định tính phù hợp và tính phân biệt của thang điểm CDAPP: sử dụng đường cong ROC để xác định khả năng tiên lượng tử vong dựa vào diện tích dưới đường cong và xác định điểm cắt có khả năng tốt nhất tiên lượng tử vong của thang điểm tổ hợp. So sánh với 2 thang điểm tham cứu là BAP-65 và CURB-65.
+ Xác định giá trị tiên lượng tử vong trong đợt cấp của thang điểm CDAPP: tính độ nhạy, đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và tiên đoán âm trong tiên lượng nguy cơ tử vong của CDAPP.