Phần 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus plantarum
1.3.1. Giới thiệu về L.plantarum.
Lactobacillus plantarum (L.plantarum) (Hình 17) là một vi khuẩn Gram- dương, thuộc nhóm vi khuẩn acid lactic (LAB) - là những vi sinh vật quan trọng trong công nghiệp. Được biết đến với khả năng tạo ra exopolysaccharides (EPS), cũng như rất được quan tâm trong các ứng dụng lên men thực phẩm vì được cho là an tồn (GRAS) và đặc tính probiotic, có khả năng cạnh tranh với các khuẩn Gram-âm cũng như Gram-dương khác. Chi Lactobacillus bao gồm một số lượng lớn các loại khác nhau thể hiện mức độ đa dạng tương đối lớn với hơn 200 lồi có tầm quan trọng trong sản xuất kinh tế, trong đó có một số chủng có khả năng tăng cường sức khỏe ở người và động vật [103]. Trong số này, L.plantarum là một thích ứng sinh học và đa năng được gặp trong nhiều loại môi trường khác nhau, bao gồm một số loại sữa, thịt, nhiều loại thực phẩm lên men và được bắt gặp như một lợi khuẩn trong hệ tiêu hóa (GI) ở người [104]. Khả năng thích ứng của lồi
L.plantarum được thể hiện ở điểm, đây là loài xuất hiện nhiều chủng mang
bộ gen lớn nhất được tìm thấy ở các lồi vi khuẩn lactic [105]. Một số chủng
L.plantarum có thể được tiếp cận về mặt di truyền và các cơng cụ di truyền
đã được phát triển ở lồi này, bao gồm hệ thống biểu hiện gen [106] và các vector có thể được sử dụng để vận chuyển gen [107]. Khả năng tồn tại liên
29 tục trong một thời gian khá dài lên đến trên 6 ngày trong đường tiêu hóa người đã thôi thúc các nhà nghiên cứu ứng dụng chúng như một phương tiện vận chuyển hay bổ xung lợi chất như enzyme, các chất điều trị bao gồm cả vắc-xin [108].
Hình 17: Hình ảnh L.plantarum dưới kính hiển vi khi được nhuộm.
1.3.2. Hệ thống biểu hiện sử dụng mơ-típ neo trên L.plantarum [106].
Có ba hệ thống neo có nguồn gốc từ L.plantarum (Hình 18) giúp hiển thị các protein, enzyme bằng cách cố định chúng bên ngoài tế bào đã được phát hiện, nghiên cứu, và ứng dụng phổ biến đó là: neo lipoprotein và hai neo thành tế bào: một khơng cộng hóa trị (miền LysM) và một liên kết cộng hóa trị (neo dựa trên enzyme sortase bằng cách sử dụng mơ LPxTG).
Hình 18: Sơ đồ tổng quan về các mơ-típ neo ở L.plantarum.
Neo màng tế bào sử dụng lipoprotein, chứa chuỗi tín hiệu đầu N với vị trí phân cắt tín hiệu peptidase (SPase II). Sự bài tiết và phân cắt qua trung gian
30
SPase II đi kèm với việc kết hợp một lipid với phần còn lại của acid amin cysteine ở đầu N của protein phân cắt SPase II và phần lipid giữ cho protein liên kết với màng. Sự kết hợp đầu tận cùng N của một protein mục tiêu với phần tận cùng N của lipoprotein tự nhiên, ở hạ lưu của cysteine được bảo tồn, do đó có thể dẫn đến gắn kết cộng hóa trị với màng tế bào.
Việc cố định các protein dị hợp vào thành tế bào bằng liên kết cộng hóa trị được thực hiện bằng cách kết hợp protein mục tiêu với phần C tận cùng của các protein có chứa cái gọi là mơ típ LPxTG. Mơ-típ neo LPxTG được theo sau bởi một trình tự xuyên màng kỵ nước và một cụm các acid amin tích điện dương. Trong quá trình chuyển vị, enzym sortase ở màng tế bào phân cắt giữa threonine và glycine, trong khi gắn cộng hóa trị phần threonine vào lớp peptidoglycan.
Nhắm mục tiêu khơng cộng hóa trị vào thành tế bào cũng là một lựa chọn và có thể đạt được bằng cách gắn các vùng LysM liên kết peptidoglycan vào protein, enzyme cần cố định. Các miền như vậy hiện diện ở dạng đơn hoặc nhiều bản sao trong protein tự nhiên và liên kết đặc biệt với các nguyên tố N- acetylglucosamine trong thành tế bào.
Phần 2: NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT MANNANASE
CỐ ĐỊNH TRÊN BẾ MẶT TẾ BÀO VI KHUẨN Lactobacillus
plantarum WCFS1
Chương này của bài tổng quan sẽ giới thiệu một nghiên cứu của Tiến sĩ Nguyễn Hoàng Minh cùng các cộng sự một phương pháp cố định mannanase trên bề mặt tế bào vi khuẩn L.plantarum chủng WCFS1 [109]. Đồng thời đề xuất quy trình sản xuất enzyme cố định này trên quy mô công nghiệp. L.plantarum WCFS1, một chủng khuẩn lạc đơn xuất phát từ chủng ban đầu là NCIMB8826 được phân lập từ nước bọt người. Chúng được biết. Chủng WCFS1 được biết đến với bộ gen lớn lên đã xác định được trình tự 3.308.274 bp của nhiễm sắc thể, và chứa 3.052 gen mã hóa protein. Đặc biệt có trên 200 gen mã hóa protein ngoại bào, nhiều protein trong số đó có khả năng liên kết với vỏ tế bào [110]. Chủng này đã được tìm thấy có khả năng sống trên 6 ngày trong hệ tiêu hóa người – một đặc điểm quan trọng cho phép
31
ứng dụng trên vật thể sống là động vật trong chăn nuôi, hay bổ sung các hợp chất cần thiết cho hệ tiêu hóa ở người.
2.1. Giới thiệu sơ lượt quát trình cố định enzyme mannanase trên
L.plantarum WCFS1 [109].
Nhóm nghiên cứu nhắm đến việc hiển thị trên bề mặt tế bào L.plantarum WCFS1 enzyme mannanase được mã hóa bởi gen ManB của B.licheniformis DSM13. Để quá trình này xảy ra, ta cần tạo lập plasmid tái tổ hợp với các thành phần cần thiết cho quá trình cố định này bào gồm: vector biểu hiện pSIP409 (Hình 19); Hai vùng trình tự khởi động (promoter) mạnh PPgm và PSlpA lần lượt từ chủng L.acidophilus NCFM và L.acidophilus ATCC4356; Gen mã hóa neo lipoprotein (Lp_1261) từ L.plantarum; Trình tự gen mã hóa cho enzyme mannanase (ManB) ; Cùng cách trình tự khác như trình tự nối (L) và Myc-đoạn gen mã hóa protein myc giúp cho việc phát hiện sự có mặt của enzyme mannanase. Thơng q các thao tác kỹ thuật gen ta có được hai plasmid tái tổ hợp với các vùng khởi động (promoter) khác nhau là pSlpA_1261ManB và pPgm_1261ManB. Sau đó chuyển hai vector tái tổ hợp này vào L.plantarum WCFS1. Kết quả thu được cho thấy các cá thể
L.plantarum mang là pSlpA_1261ManB phát triển chậm hơn so với các cá
thể mang pPgm_1261ManB, nhưng khi so sánh về hoạt độ riêng của enzyme mannanase cao nhất được biểu hiện trên bề mặt của L.plantarum thì chủng mang promoter SlpA cao hơn hẳn với 3500 U/g trọng lương khô tế bào so với 1200 U/g (Hình20). Vì thế để đạt hiệu quả cao cũng như tối ưu về mặt kinh tế trong quá trình sản xuất trên quy mô công nghiệp, việc sử dụng plasmid tái tổ hợp pSlpA_1261ManB trong việc cố định enzyme mannanase trên L.plantarum WCFS1 là điều cần thiết.
32
Hình 19: Cấu trúc của vector biểu hiện pSIP409
33 2.2. Xử lí plasmid cần tạo dòng (và biểu hiện).
Tiến hành mở vòng plasmid bằng hai enzyme cắt hạn chế Bgl II và EcoRI. Thay thế promoter PsppQ bằng promoter mạnh PslpA (có trong thành phần của đoạn gen được chuyển vào).
2.3. Xây dựng vector tái tổ hợp pSlpA_1261ManB.
Để xây dựng plasmid pSlpA_1261, hai đoạn SlpA (~554 bp) và Lp1261- manB-myc đã được khuyếch đại PCR bằng cách sử dụng DNA từ bộ gen của
L.acidophilus ATCC4356 và plasmid pSIP_1261ManB làm mạch khuôn,
tương ứng với việc sử dụng lần lượt hai cặp mồi đó là ATGCAGATCTATAAAGTTGTTTGATAAATGCTCAAC(M5)//TGCAG CTGTTTTGAAATTCATGTGGTCTTTTCCTCC(M6)vàGGAGGAAAA GACCACATGTGGTCTTTTCCTCC(M7)//ATGCGAATTCTTACAGAT CCTCTTCTGAGATG(M4). Hai đoạn kết quả được hợp nhất bằng PCR mở rộng chồng chéo, bao gồm hai bước PCR. Bước PCR đầu tiên được thực hiện mà không cần thêm mồi trong các điều kiện sau: biến tính ban đầu ở 98°C trong 30 giây, tiếp theo là 15 chu kỳ biến tính ở 98°C trong 10 giây, ủ ở 65°C trong 20 giây, kéo dài ở 72°C trong 1 phút, và kéo dài thêm 5 phút ở 72°C. Trong bước PCR thứ hai, cặp mồi M5//M4 được sử dụng để khuếch đại toàn bộ phần chèn chứa vị trí enzyme cắt giới giạn Bgl II đầu N và vị trí
EcoR I đầu cuối C. Các mồi được thêm vào các ống phản ứng theo sau 20
chu kỳ như đã mô tả trong bước PCR đầu tiên nhưng nhiệt độ ủ là 51°C. Sau đó, đoạn DNA hợp nhất chứa SlpA - lp1261- manB - myc (~1657 bp) được liên kết vào vector Bgl II- EcoR I pSIP409GusA (~5,4kb), tạo ra plasmid
pSlpA_1261ManB (Hình 21) Vector này được tạo dòng trong E.coli NEB5α, trước khi được biêu hiện trong L.plantarum WCFS1.
Hình 21: Cấu trúc vector tái tổ hợp pSlpA_1261ManB
2.4. Sự biểu hiện gen cấu trúc ở L.plantarum.
Plasmid pSlpA_1261ManB được biến nạp vào tế bào L.plantarum
34 biểu hiện gen, tiến hành nuôi cấy qua đêm L.plantarum WCFS1 trong 50 ml mơi trường MRS có chứa 5 µg/ml erythromycin đến mật độ tế bào với OD600 là 0,1 và ủ ở 37ᴼC mà không nuối cấy lắc. Sau 4h tiến hành thu hoạch ở OD600 khoảng 0,6-0,9 bằng cách ly tâm (4000 x g, 10 phút ở 4ᴼC). Sau đó dịch tế bào được rửa bằng đệm phosphate PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4) và sau đó được tái lơ lửng trong 1 ml PBS chứa 20 µl PMSF 50 mM. Việc phá vỡ tế bào được thực hiện bằng máy nghiền thủy tinh Precelly 24 với kích thước hạt 0,1 mm. Dịch chiết khơng chứa tế bào thu được sau 5 phút ly tâm ở 10.000 x g tại 4ᴼC, được sử dụng để phân tích Western blot. Kết quả phân tích được cho thấy chủng mang plasmid pSlpA_1261ManB chứa gen cấu trúc neo lipoprotein mang mannanase (ManB) và promoter mạnh SlpA đã biểu hiện mannanase với khối lượng phân tử khoảng 51 kDa (Hình22), được biểu hiện ở cột số 3.
Hình 22: Kích thước mannanase thu được ở tế bào chứa plasmid pSlpA_1261ManB (cột 3) bằng phân tích Western blot.
2.5. Sự hiển thị mannanase trên bề mặt tế bào L.plantarum.
Để xác định sự có mặt của mannanase được cố định bằng neo lipoprotein biểu hiện bên ngoài tế bào L.plantarum WCFS1 mang plasmid
pSlpA_1261ManB. Tiến hành các phép do dòng chảy tế bào và phân tích kính bằng kính hiển vi huỳnh quang miễn dịch gián tiếp. 1 ml dịch nuôi cấy
35 tế bào (OD600 ~ 0,5) được thu hoạch sau 4h ủ và tế bào được lưu lại trong 50 µl PBS chứa 1% BSA (PBS-B) và 0,4 µl kháng thể đơn dịng kháng Myc (pha loãng với tỉ lệ 1:5000 trong PBS-B). Sau khi ủ ở RT trong 30 phút, dịch huyền phù của vi khuẩn được ly tâm ở 5000 x g trong 3 phút ở 4ᴼC và rứa ba lần với 500 µl PBS-B. Sau đó các tế bào được ủ với 50 µl PBS-B và 0,8 µl IgG (pha loãng với tỉ lệ 1:2500 trong PBS-B) trong 30 phút ở RT trong bóng tối. Tiến hành ly tâm 4000 x g trong 3 phút ở 4ᴼC để thu nhận tế bào, sau đó rửa năm lần với 500 µl PBS, các tế bào nhuộm màu được phân tích bằng phương pháp đo dịng chảy tế bào bằng máy phân tích MACSQuant đã cho thấy sự xuất hiện của mannanase cố định bên ngoài tế bào (đường màu xanh) (Hình 23-phải). Đối với kinh hiển vi huỳnh quan miễn dịch gián tiếp, vi khuẩn nhuộm màu được quan sát dưới kính hiển vi quét laser Leica TCS SP5II bằng cách sử dụng dịng laser argon với bước sóng 488 nm, được đặt trong cửa sổ huỳnh quang với khoảng bước sóng từ 505-550 nm, hình ảnh thu được bằng vật kính PL APO 63x/1.40 (Hình 23 -trái).
Hình 23: Sự cố định mannanase trên bề mặt tế bào L.plantarum WCFS1 (mang plasmid pSlpA_1261ManB) bằng mơ-típ neo lipoprotein bằng 2 phương pháp là phân tích dịng chảy tế bào và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang.
2.6. Phân tích enzyme.
2.6.1. Phân tích hoạt độ của enzyme cố định.
Hỗn hợp phản ứng bao gồm 100 µl dịch huyền phù tế bào hiển thị mannanase trong PBS và 900 µl dung dịch galactomannan 0,5% (w/v). Dung dịch galactomannan được chuẩn bị bằng cách hòa tan LBG trong dung dịch đệm natri citrat Na3C6H5O7 50 mM (pH 6,0) ở 50ᴼC trong 30 phút.
36 Tế bào hiển thị hiển thị enzyme được thu nhận sau khi nuôi cấy 4h bằng cách ly tâm ở 4000 x g trong 5 phút ở 4ᴼC. Các tế bào thu được từ 50 ml từ dịch nuôi cấy được rửa hai lần bằng PBS và tái lơ lửng trong 100 µl PBS. Các tế bào cố định mannanase được ủ trong 900 µl dung dịch galactomannan trên ở 37ᴼC và trộn với tốc độ 600 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó các tế bào được loại bỏ bằng ly tâm (5000 x g trong 2 phút ở 4ᴼC) và lượng đường khử được giải phóng trong phần nổi phía trên của phản ứng sẽ được phân tích bằng kỹ thuật DNS. Quá trình được thực hiện như sau: 100 µl phần nổi được trộn với 100 µl DNS (acid dinitrosalicylic), sau đó đun nóng ở 99ᴼC trong 10 phút, làm lạnh trên đá trong 5 phút. Sau đó được pha lỗng với 800 µl nước khử ion, trước khi đo độ hấp phụ ở bước sóng 540 nm, sử dụng 1-5 µmol/ml D-mannose làm chất chuẩn.
2.6.2. Phân tích tính ổn định của mannanase cố định bằng neo lipoprotein. Để xác định độ ổn định xúc tác của các tế bào hiển thị β-mannanase ở Để xác định độ ổn định xúc tác của các tế bào hiển thị β-mannanase ở 37°C, các tế bào được thu thập từ các mẫu cấy 4 giờ sau khi cấy và được tái lơ lửng trong 100 µl PBS trước khi ủ ở 37°C. Tại những khoảng thời gian nhất định, hoạt tính enzym của các tế bào hiển thị ManB được đo bằng cách sử dụng LBG 0,5% làm chất nền. Tế bào thu được sau khi ủ với chất nền được rửa bằng 500 µl PBS và được thu thập bằng cách ly tâm ở 5000 × g, ở nhiệt độ 4°C trong 2 phút. Sau đó, các tế bào được đình chỉ lại trong 100 µl PBS và các hoạt động của mannanase được đo như mơ tả ở (Hình 24). Quy trình này được lặp lại trong một số chu kỳ để đánh giá số chu kỳ sử dụng của bề mặt hiển thị β-mannanase.
37
Hình 24: Tỉ lệ mannanase còn cố định lại trên màng tế bào sau các chu kì.
Từ kết quả thu được cho thấy enzyme β-mannanase được biểu hiện nhờ plasmid pSlpA_1261ManB giảm đến gần một nữa (51%) so với ban đầu.Tuy nhiên hoạt động của mannanase hiển thị ở L.plantarum chứa plasmid này ở các chu kì khác nhau trong PBS ở 37ᴼC cho thấy một sự ổn định đáng kể (Hình 25).
38 3.7. Đề xuất phương pháp sản xuất enzyme mannanase cố định bằng mơ-típ neo lipoprotein trên L.plantarum WCFS1.
Thứ tự các
bước Tên các bước
Cụ thể 1 Xử lý vector cần tạo dòng và biểu hiện pSIP409 Mở vòng vector pSIP409 để chèn đoạn DNA tái tổ hợp SlpA - lp1261- manB - myc
2 plasmid tái tổ hợp Xây dựng và tạo pSlpA_1261ManB
Xây dựng DNA tái tổ hợp SlpA - lp1261- manB - myc và chèn vào vector pSIP409 đã mở vòng.
3
Chuyển vector tái tổ hợp vào
L.plantarum WCFS1
Biến nạp plasmid tái tổ hợp pSlpA_1261ManB vào L.plantarum WCFS1 4 Phân tích Wester blot Phát hiện tạo thành enzyme mannanase từ plasmid pSlpA_1261ManB 5 Phát hiện dịng mang pSlpA_1261ManB Phân tích enzyme Xác định hoạt độ enzyme cố định cũng như độ bền của liên kết giữa mannanase với neo lipoprotein
6
Phân lập và bảo quản giống
Sau khi tìm ra được chủng biểu hiện mong muốn, tiến hành phân lập để tạo giống thuần
7
Tiến hành ni chiềm
Sau khi có được giống thuần thì tiến hành ni chiềm trong thùng ni cấy.
8
Cô đặc
9
Sấy thăng hoa
Bảo quản chủng L.plantarum WCFS1 mang enzyme cố định manananase.
39 Cần lưu ý các điều kiện về pH, nồng độ chất tan, cũng như mật độ L.plantarum, cũng như thời gian ni cấy vì các yếu tố này có thể ảnh hưởng đên hoạt độ cũng như sự ổn định enzyme mannanase cố định trên neo lipoprotein.
Tài liệu tham khảo
[1] B. M. Brena and F. Batista-Viera, “Immobilization of Enzymes,” Humana Press, 2006, pp. 15–30.
[2] P. Grunwald, “Immobilized biocatalysts,” Catalysts, vol. 8, no. 9. MDPI AG, p. 386, Sep. 09, 2018, doi: 10.3390/catal8090386.
[3] B. Brena, P. González-Pombo, and F. Batista-Viera, “Immobilization of enzymes: A literature survey,” Methods in Molecular Biology, vol. 1051. Humana Press
Inc., pp. 15–31, 2013, doi: 10.1007/978-1-62703-550-7_2.
[4] P. Bracco, G. Torrelo, S. Noordam, G. de Jong, and U. Hanefeld, “Immobilization of Prunus amygdalus hydroxynitrile lyase on celite,” Catalysts, vol. 8, no. 7, p. 287, Jul. 2018, doi: 10.3390/catal8070287.
[5] H. M. Nguyen et al., “Display of a β-mannanase and a chitosanase on the cell
surface of Lactobacillus plantarum towards the development of whole-cell biocatalysts,” Microb. Cell Fact., vol. 15, no. 1, pp. 1–14, Oct. 2016, doi: