Phần 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.5. Sự hiển thị mannanase trên bề mặt tế bào L.plantarum
Để xác định sự có mặt của mannanase được cố định bằng neo lipoprotein biểu hiện bên ngoài tế bào L.plantarum WCFS1 mang plasmid
pSlpA_1261ManB. Tiến hành các phép do dòng chảy tế bào và phân tích kính bằng kính hiển vi huỳnh quang miễn dịch gián tiếp. 1 ml dịch nuôi cấy
35 tế bào (OD600 ~ 0,5) được thu hoạch sau 4h ủ và tế bào được lưu lại trong 50 µl PBS chứa 1% BSA (PBS-B) và 0,4 µl kháng thể đơn dịng kháng Myc (pha lỗng với tỉ lệ 1:5000 trong PBS-B). Sau khi ủ ở RT trong 30 phút, dịch huyền phù của vi khuẩn được ly tâm ở 5000 x g trong 3 phút ở 4ᴼC và rứa ba lần với 500 µl PBS-B. Sau đó các tế bào được ủ với 50 µl PBS-B và 0,8 µl IgG (pha lỗng với tỉ lệ 1:2500 trong PBS-B) trong 30 phút ở RT trong bóng tối. Tiến hành ly tâm 4000 x g trong 3 phút ở 4ᴼC để thu nhận tế bào, sau đó rửa năm lần với 500 µl PBS, các tế bào nhuộm màu được phân tích bằng phương pháp đo dòng chảy tế bào bằng máy phân tích MACSQuant đã cho thấy sự xuất hiện của mannanase cố định bên ngoài tế bào (đường màu xanh) (Hình 23-phải). Đối với kinh hiển vi huỳnh quan miễn dịch gián tiếp, vi khuẩn nhuộm màu được quan sát dưới kính hiển vi quét laser Leica TCS SP5II bằng cách sử dụng dòng laser argon với bước sóng 488 nm, được đặt trong cửa sổ huỳnh quang với khoảng bước sóng từ 505-550 nm, hình ảnh thu được bằng vật kính PL APO 63x/1.40 (Hình 23 -trái).
Hình 23: Sự cố định mannanase trên bề mặt tế bào L.plantarum WCFS1 (mang plasmid pSlpA_1261ManB) bằng mơ-típ neo lipoprotein bằng 2 phương pháp là phân tích dịng chảy tế bào và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang.