Phần 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.6. Phân tích enzyme
2.6.1. Phân tích hoạt độ của enzyme cố định.
Hỗn hợp phản ứng bao gồm 100 µl dịch huyền phù tế bào hiển thị mannanase trong PBS và 900 µl dung dịch galactomannan 0,5% (w/v). Dung dịch galactomannan được chuẩn bị bằng cách hòa tan LBG trong dung dịch đệm natri citrat Na3C6H5O7 50 mM (pH 6,0) ở 50ᴼC trong 30 phút.
36 Tế bào hiển thị hiển thị enzyme được thu nhận sau khi nuôi cấy 4h bằng cách ly tâm ở 4000 x g trong 5 phút ở 4ᴼC. Các tế bào thu được từ 50 ml từ dịch nuôi cấy được rửa hai lần bằng PBS và tái lơ lửng trong 100 µl PBS. Các tế bào cố định mannanase được ủ trong 900 µl dung dịch galactomannan trên ở 37ᴼC và trộn với tốc độ 600 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó các tế bào được loại bỏ bằng ly tâm (5000 x g trong 2 phút ở 4ᴼC) và lượng đường khử được giải phóng trong phần nổi phía trên của phản ứng sẽ được phân tích bằng kỹ thuật DNS. Q trình được thực hiện như sau: 100 µl phần nổi được trộn với 100 µl DNS (acid dinitrosalicylic), sau đó đun nóng ở 99ᴼC trong 10 phút, làm lạnh trên đá trong 5 phút. Sau đó được pha lỗng với 800 µl nước khử ion, trước khi đo độ hấp phụ ở bước sóng 540 nm, sử dụng 1-5 µmol/ml D-mannose làm chất chuẩn.
2.6.2. Phân tích tính ổn định của mannanase cố định bằng neo lipoprotein. Để xác định độ ổn định xúc tác của các tế bào hiển thị β-mannanase ở Để xác định độ ổn định xúc tác của các tế bào hiển thị β-mannanase ở 37°C, các tế bào được thu thập từ các mẫu cấy 4 giờ sau khi cấy và được tái lơ lửng trong 100 µl PBS trước khi ủ ở 37°C. Tại những khoảng thời gian nhất định, hoạt tính enzym của các tế bào hiển thị ManB được đo bằng cách sử dụng LBG 0,5% làm chất nền. Tế bào thu được sau khi ủ với chất nền được rửa bằng 500 µl PBS và được thu thập bằng cách ly tâm ở 5000 × g, ở nhiệt độ 4°C trong 2 phút. Sau đó, các tế bào được đình chỉ lại trong 100 µl PBS và các hoạt động của mannanase được đo như mơ tả ở (Hình 24). Quy trình này được lặp lại trong một số chu kỳ để đánh giá số chu kỳ sử dụng của bề mặt hiển thị β-mannanase.
37
Hình 24: Tỉ lệ mannanase cịn cố định lại trên màng tế bào sau các chu kì.
Từ kết quả thu được cho thấy enzyme β-mannanase được biểu hiện nhờ plasmid pSlpA_1261ManB giảm đến gần một nữa (51%) so với ban đầu.Tuy nhiên hoạt động của mannanase hiển thị ở L.plantarum chứa plasmid này ở các chu kì khác nhau trong PBS ở 37ᴼC cho thấy một sự ổn định đáng kể (Hình 25).
38 3.7. Đề xuất phương pháp sản xuất enzyme mannanase cố định bằng mơ-típ neo lipoprotein trên L.plantarum WCFS1.
Thứ tự các
bước Tên các bước
Cụ thể 1 Xử lý vector cần tạo dòng và biểu hiện pSIP409 Mở vòng vector pSIP409 để chèn đoạn DNA tái tổ hợp SlpA - lp1261- manB - myc
2 plasmid tái tổ hợp Xây dựng và tạo pSlpA_1261ManB
Xây dựng DNA tái tổ hợp SlpA - lp1261- manB - myc và chèn vào vector pSIP409 đã mở vòng.
3
Chuyển vector tái tổ hợp vào
L.plantarum WCFS1
Biến nạp plasmid tái tổ hợp pSlpA_1261ManB vào L.plantarum WCFS1 4 Phân tích Wester blot Phát hiện tạo thành enzyme mannanase từ plasmid pSlpA_1261ManB 5 Phát hiện dòng mang pSlpA_1261ManB Phân tích enzyme Xác định hoạt độ enzyme cố định cũng như độ bền của liên kết giữa mannanase với neo lipoprotein
6
Phân lập và bảo quản giống
Sau khi tìm ra được chủng biểu hiện mong muốn, tiến hành phân lập để tạo giống thuần
7
Tiến hành nuôi chiềm
Sau khi có được giống thuần thì tiến hành ni chiềm trong thùng nuôi cấy.
8
Cô đặc
9
Sấy thăng hoa
Bảo quản chủng L.plantarum WCFS1 mang enzyme cố định manananase.
39 Cần lưu ý các điều kiện về pH, nồng độ chất tan, cũng như mật độ L.plantarum, cũng như thời gian ni cấy vì các yếu tố này có thể ảnh hưởng đên hoạt độ cũng như sự ổn định enzyme mannanase cố định trên neo lipoprotein.
Tài liệu tham khảo
[1] B. M. Brena and F. Batista-Viera, “Immobilization of Enzymes,” Humana Press, 2006, pp. 15–30.
[2] P. Grunwald, “Immobilized biocatalysts,” Catalysts, vol. 8, no. 9. MDPI AG, p. 386, Sep. 09, 2018, doi: 10.3390/catal8090386.
[3] B. Brena, P. González-Pombo, and F. Batista-Viera, “Immobilization of enzymes: A literature survey,” Methods in Molecular Biology, vol. 1051. Humana Press
Inc., pp. 15–31, 2013, doi: 10.1007/978-1-62703-550-7_2.
[4] P. Bracco, G. Torrelo, S. Noordam, G. de Jong, and U. Hanefeld, “Immobilization of Prunus amygdalus hydroxynitrile lyase on celite,” Catalysts, vol. 8, no. 7, p. 287, Jul. 2018, doi: 10.3390/catal8070287.
[5] H. M. Nguyen et al., “Display of a β-mannanase and a chitosanase on the cell
surface of Lactobacillus plantarum towards the development of whole-cell biocatalysts,” Microb. Cell Fact., vol. 15, no. 1, pp. 1–14, Oct. 2016, doi:
10.1186/s12934-016-0570-z.
[6] C. Mateo, J. M. Palomo, G. Fernandez-Lorente, J. M. Guisan, and R. Fernandez- Lafuente, “Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques,” Enzyme and Microbial Technology, vol. 40, no. 6.
Elsevier, pp. 1451–1463, May 02, 2007, doi: 10.1016/j.enzmictec.2007.01.018. [7] M. Y. Chang and R. S. Juang, “Activities, stabilities, and reaction kinetics of three
free and chitosan-clay composite immobilized enzymes,” Enzyme Microb. Technol., vol. 36, no. 1, pp. 75–82, Jan. 2005, doi: 10.1016/j.enzmictec.2004.06.013.
[8] L. M. P. Sampaio et al., “Laccase immobilization on bacterial nanocellulose
membranes: Antimicrobial, kinetic and stability properties,” Carbohydr. Polym., vol. 145, pp. 1–12, Jul. 2016, doi: 10.1016/j.carbpol.2016.03.009.
[9] D. M. Liu, J. Chen, and Y. P. Shi, “Advances on methods and easy separated support materials for enzymes immobilization,” TrAC - Trends in Analytical Chemistry, vol. 102. Elsevier B.V., pp. 332–342, May 01, 2018, doi:
10.1016/j.trac.2018.03.011.
[10] “A single step purification, immobilization, and hyperactivation of lipases via interfacial adsorption on strongly hydrophobic supports - Bastida - 1998 - Biotechnology and Bioengineering - Wiley Online Library.” https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/(SICI)1097-
40 0290(19980605)58:5%3C486::AID-BIT4%3E3.0.CO;2-9 (accessed Jun. 02, 2021).
[11] S. Pang, Y. Wu, X. Zhang, B. Li, J. Ouyang, and M. Ding, “Immobilization of laccase via adsorption onto bimodal mesoporous Zr-MOF,” Process Biochem., vol. 51, no. 2, pp. 229–239, Feb. 2016, doi: 10.1016/j.procbio.2015.11.033. [12] M. Bilal, H. M. N. Iqbal, H. Hu, W. Wang, and X. Zhang, “Enhanced bio-catalytic
performance and dye degradation potential of chitosan-encapsulated horseradish peroxidase in a packed bed reactor system,” Sci. Total Environ., vol. 575, pp.
1352–1360, Jan. 2017, doi: 10.1016/j.scitotenv.2016.09.215.
[13] M. Bilal, M. Iqbal, H. Hu, and X. Zhang, “Mutagenicity and cytotoxicity assessment of biodegraded textile effluent by Ca-alginate encapsulated manganese peroxidase,” Biochem. Eng. J., vol. 109, pp. 153–161, May 2016, doi: 10.1016/j.bej.2016.01.020.
[14] I. Karube and S. Suzuki, “Electrochemical preparation of urease-collagen membrane,” Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 47, no. 1, pp. 51–54, Apr. 1972, doi: 10.1016/S0006-291X(72)80008-1.
[15] Y. Chen et al., “Immobilization and stabilization of cholesterol oxidase on
modified sepharose particles,” Int. J. Biol. Macromol., vol. 56, pp. 6–13, May
2013, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2013.01.026.
[16] D. S. Rodrigues, A. A. Mendes, W. S. Adriano, L. R. B. Gonỗalves, and R. L. C. Giordano, “Multipoint covalent immobilization of microbial lipase on chitosan and agarose activated by different methods,” J. Mol. Catal. B Enzym., vol. 51, no. 3–4, pp. 100–109, Apr. 2008, doi: 10.1016/j.molcatb.2007.11.016.
[17] K. Singh and A. M. Kayastha, “Optimal immobilization of α-amylase from wheat (Triticum aestivum) onto DEAE-cellulose using response surface methodology and its characterization,” J. Mol. Catal. B Enzym., vol. 104, pp. 75–81, Jun. 2014, doi: 10.1016/j.molcatb.2014.03.014.
[18] M. A. Abdel-Naby, “Immobilization of Aspergillus niger NRC 107 xylanase and β-xylosidase, and properties of the immobilized enzymes,” Appl. Biochem. Biotechnol., vol. 38, no. 1–2, pp. 69–81, Jan. 1993, doi: 10.1007/BF02916413.
[19] P. Shinde, M. Musameh, Y. Gao, A. J. Robinson, and I. (Louis) Kyratzis, “Immobilization and stabilization of alcohol dehydrogenase on polyvinyl alcohol fibre,” Biotechnol. Reports, vol. 19, p. e00260, Sep. 2018, doi:
10.1016/j.btre.2018.e00260.
[20] D. Zhang, H. E. Hegab, Y. Lvov, L. Dale Snow, and J. Palmer, “Immobilization of cellulase on a silica gel substrate modified using a 3-APTES self-assembled monolayer,” Springerplus, vol. 5, no. 1, pp. 1–20, Jan. 2016, doi: 10.1186/s40064- 016-1682-y.
[21] T. Pompe et al., “Maleic anhydride copolymers - A versatile platform for
molecular biosurface engineering,” Biomacromolecules, vol. 4, no. 4, pp. 1072– 1079, Jul. 2003, doi: 10.1021/bm034071c.
[22] T. Lipatova, L. Chupryna, … G. P.-U. kyi, and undefined 1975, “Immobilization of trypsin on polyurethane matrix,” europepmc.org, Accessed: Jun. 02, 2021.
[Online]. Available: https://europepmc.org/article/med/1209783.
[23] Z. C. Hu, R. A. Korus, and K. E. Stormo, “Characterization of immobilized enzymes in polyurethane foams in a dynamic bed reactor,” Appl. Microbiol.
41
Biotechnol., vol. 39, no. 3, pp. 289–295, Jun. 1993, doi: 10.1007/BF00192080.
[24] M. G. Slade, “A-amylase immobilized on plastic supports: Stabilities, ph and temperature profiles and kinetic parameters,” Biomater. Artif. Cells Immobil. Biotechnol., vol. 21, no. 4, pp. 487–525, 1993, doi: 10.3109/10731199309117654.
[25] M. G. Roig, J. F. Kennedy, and M. G. Garaita, “Immobilization of carbohydrases on epoxide-, isocyanate-, acid chloride-, and carboxylic acid-activated plastic supports,” J. Biomater. Sci. Polym. Ed., vol. 6, no. 7, pp. 661–673, 1995, doi:
10.1163/156856294X00608.
[26] H. S. Liu, “Immobilization of isoamylase on carboxymethyl-cellulose and chitin,”
Appl. Biochem. Biotechnol. - Part A Enzym. Eng. Biotechnol., vol. 66, no. 1, pp.
57–67, 1997, doi: 10.1007/BF02788807.
[27] M. Kobayashi, S. Yanagihara, and E. Ichishima, “Preparation and Characterization of Taka-Amylase a Attached to Carboxymethyl Dextran by Water-Soluble Carbodiimide,” Agric. Biol. Chem., vol. 53, no. 12, pp. 3133–3138,
1989, doi: 10.1080/00021369.1989.10869823.
[28] M. T. Neves-Petersen, “Photonic activation of disulfide bridges achieves oriented protein immobilization on biosensor surfaces,” Protein Sci., vol. 15, no. 2, pp.
343–351, Feb. 2006, doi: 10.1110/ps.051885306.
[29] M. Bilal, H. M. N. Iqbal, H. Hu, W. Wang, and X. Zhang, “Development of horseradish peroxidase-based cross-linked enzyme aggregates and their environmental exploitation for bioremediation purposes,” J. Environ. Manage.,
vol. 188, pp. 137–143, Mar. 2017, doi: 10.1016/j.jenvman.2016.12.015.
[30] P. S. Daugherty, “Protein engineering with bacterial display,” Current Opinion in
Structural Biology, vol. 17, no. 4. Elsevier Current Trends, pp. 474–480, Aug. 01,
2007, doi: 10.1016/j.sbi.2007.07.004.
[31] G. Georgiou, C. Stathopoulos, P. S. Daugherty, A. R. Nayak, B. L. Iverson, and R. Curtiss, “Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: From the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines,”
Nature Biotechnology, vol. 15, no. 1. Nature Publishing Group, pp. 29–34, 1997,
doi: 10.1038/nbt0197-29.
[32] P. Martineau, A. Charbit, C. Leclerc, C. Werts, D. O’Callaghan, and M. Hofnung, “A genetic system to elicit and monitor anti-peptide antibodies without peptide synthesis,” Nat. Biotechnol., vol. 9, no. 2, pp. 170–172, 1991, doi:
10.1038/nbt0291-170.
[33] R. D. Richins, I. Kaneva, A. Mulchandani, and W. Chen, “Biodegradation of Organophosphorus Pesticides by Surface-Expressed Organophosphorus Hydrolase,” Nat. Biotechnol., vol. 15, no. 10, pp. 984–987, 1997, doi:
10.1038/nbt1097-984.
[34] J. K. Dhillon, P. D. Drew, and A. J. R. Porter, “Bacterial surface display of an anti-pollutant antibody fragment,” Lett. Appl. Microbiol., vol. 28, no. 5, pp. 350– 354, May 1999, doi: 10.1046/j.1365-2672.1999.00552.x.
[35] S. Shibasaki et al., “Creation of cell surface-engineered yeast that display different fluorescent proteins in response to the glucose concentration,” Appl. Microbiol.
Biotechnol., vol. 57, no. 4, pp. 528–533, 2001, doi: 10.1007/s002530100767.
[36] W. Tischer and F. Wedekind, “Immobilized Enzymes: Methods and Applications,” 1999, pp. 95–126.
42 [37] H. Chang, S. L.-J. of biotechnology, and undefined 2000, “Modification with a phosphorylation tag of PKA in the TraT-based display vector of Escherichia coli,”
Elsevier, Accessed: Jun. 03, 2021. [Online]. Available: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165699002278.
[38] H. H. Chang, S. Y. Sheu, and S. J. Lo, “Expression of foreign antigens on the surface of Escherichia coli by fusion to the outer membrane protein traT,” J. Biomed. Sci., vol. 6, no. 1, pp. 64–70, 1999, doi: 10.1007/bf02256425.
[39] J. Lee, K. Shin, J. Pan, C. K.-N. biotechnology, and undefined 2000, “Surface- displayed viral antigens on Salmonella carrier vaccine,” nature.com, Accessed:
Jun. 03, 2021. [Online]. Available:
https://www.nature.com/articles/nbt0600_645.
[40] B. Stentebjerg-Olesen, L. Pallesen, L. B. Jensen, G. Christiansen, and P. Klemm, “Authentic display of a cholera toxin epitope by chimeric type 1 fimbriae: Effects of insert position and host background,” Microbiology, vol. 143, no. 6, pp. 2027– 2038, Jun. 1997, doi: 10.1099/00221287-143-6-2027.
[41] W. H. Bingle, J. F. Nomellini, and J. Smit, “Cell-surface display of a Pseudomonas aeruginosa strain K pilin peptide within the paracrystalline S-layer of Caulobacter crescentus,” Mol. Microbiol., vol. 26, no. 2, pp. 277–288, Oct.
1997, doi: 10.1046/j.1365-2958.1997.5711932.x.
[42] J. Maurer, J. Jose, and T. F. Meyer, “Autodisplay: One-component system for efficient surface display and release of soluble recombinant proteins from Escherichia coli,” J. Bacteriol., vol. 179, no. 3, pp. 794–804, 1997, doi:
10.1128/jb.179.3.794-804.1997.
[43] T. Ngoc Nguyen et al., “Hydrophobicity engineering to facilitate surface display of heterologous gene products on Staphylococcus xylosus,” J. Biotechnol., vol.
42, no. 3, pp. 207–219, Oct. 1995, doi: 10.1016/0168-1656(95)00081-Z.
[44] I. Benhar et al., “Highly efficient selection of phage antibodies mediated by
display of antigen as Lpp-OmpA’ fusions on live bacteria,” J. Mol. Biol., vol. 301, no. 4, pp. 893–904, Aug. 2000, doi: 10.1006/jmbi.2000.4021.
[45] H. Gỹl, S. ệzỗelik, O. Sagdiỗ, and M. Certel, “Sourdough bread production with lactobacilli and S. cerevisiae isolated from sourdoughs,” Process Biochem., vol. 40, no. 2, pp. 691–697, Feb. 2005, doi: 10.1016/j.procbio.2004.01.044.
[46] E. F. Vieira and C. Delerue-Matos, “Exploitation of Saccharomyces cerevisiae Enzymes in Food Processing and Preparation of Nutraceuticals and Pharmaceuticals,” Springer, Singapore, 2020, pp. 41–62.
[47] H. Nikaido, M. V.-M. reviews, and undefined 1985, “Molecular basis of bacterial outer membrane permeability.,” ncbi.nlm.nih.gov, Accessed: Jun. 03, 2021.
[Online]. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc373015/. [48] S. Lory, “Determinants of extracellular protein secretion in gram-negative
bacteria,” Journal of Bacteriology, vol. 174, no. 11. American Society for
Microbiology (ASM), pp. 3423–3428, 1992, doi: 10.1128/jb.174.11.3423- 3428.1992.
[49] C. Hoischen, C. Fritsche, J. Gumpert, M. Westermann, K. Gura, and B. Fahnert, “Novel bacterial membrane surface display system using cell wall-less L-forms of Proteus mirabilis and Escherichia coli,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 68, no. 2, pp. 525–531, 2002, doi: 10.1128/AEM.68.2.525-531.2002.
43 [50] R. Godlewska, K. Wiśniewska, Z. Pietras, and E. K. Jagusztyn-Krynicka, “Peptidoglycan-associated lipoprotein (Pal) of Gram-negative bacteria: Function, structure, role in pathogenesis and potential application in immunoprophylaxis: Minireview,” FEMS Microbiology Letters, vol. 298, no. 1. Oxford Academic, pp. 1–11, Sep. 01, 2009, doi: 10.1111/j.1574-6968.2009.01659.x.
[51] T. Clavel, P. Germon, A. Vianney, R. Portalier, and J. C. Lazzaroni, “TolB protein of Escherichia coli K-12 interacts with the outer membrane peptidoglycan- associated proteins Pal, Lpp and OmpA,” Mol. Microbiol., vol. 29, no. 1, pp. 359– 367, Jul. 1998, doi: 10.1046/j.1365-2958.1998.00945.x.
[52] J. ‐C Lazzaroni and R. Portalier, “The excC gene of Escherichia coli K‐12 required for cell envelope integrity encodes the peptidoglycan‐associated lipoprotein (PAL),” Mol. Microbiol., vol. 6, no. 6, pp. 735–742, Mar. 1992, doi: 10.1111/j.1365-2958.1992.tb01523.x.
[53] J. Jose, J. Krämer, T. Klauser, J. Pohlner, and T. F. Meyer, “Absence of periplasmic DsbA oxidoreductase facilitates export of cysteine-containing passenger proteins to the Escherichia coli cell surface via the Iga(β) autotransporter pathway,” Gene, vol. 178, no. 1–2, pp. 107–110, Oct. 1996, doi: 10.1016/0378-1119(96)00343-5.
[54] J. Jose, R. Bernhardt, and F. Hannemann, “Cellular surface display of dimeric Adx and whole cell P450-mediated steroid synthesis on E. coli,” J. Biotechnol., vol. 95, no. 3, pp. 257–268, May 2002, doi: 10.1016/S0168-1656(02)00030-5. [55] “Enhanced bioaccumulation of heavy metals by bacterial cells displaying
synthetic phytochelatins - Bae - 2000 - Biotechnology and Bioengineering - Wiley Online Library.” https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/1097- 0290(20001205)70:5%3C518::AID-BIT6%3E3.0.CO;2-5 (accessed Jun. 04, 2021).
[56] H. C. Jung, J. M. Lebeault, and J. G. Pan, “Surface display of Zymomonas mobilis levansucrase by using the ice- nucleation protein of Pseudomonas syringae,” Nat.
Biotechnol., vol. 16, no. 6, pp. 576–580, Jun. 1998, doi: 10.1038/nbt0698-576.
[57] H. C. Jung, J. H. Park, S. H. Park, J. M. Lebeault, and J. G. Pan, “Expression of carboxymethylcellulase on the surface of Escherichia coli using Pseudomonas syringae ice nucleation protein,” Enzyme Microb. Technol., vol. 22, no. 5, pp.
348–354, Apr. 1998, doi: 10.1016/S0141-0229(97)00224-X.
[58] M. G. Kornacker and A. P. Pugsley, “The normally periplasmic enzyme β‐ lactamase is specifically and efficiently translocated through the Escherichia coli outer membrane when it is fused to the cell‐surface enzyme pullulanase,” Mol. Microbiol., vol. 4, no. 7, pp. 1101–1109, Jul. 1990, doi: 10.1111/j.1365-
2958.1990.tb00684.x.
[59] Z. Xu, S. L.-A. and E. Microbiology, and undefined 1999, “Display of polyhistidine peptides on the Escherichia coli cell surface by using outer membrane protein C as an anchoring motif,” ncbi.nlm.nih.gov, Accessed: Jun. 04,
2021. [Online]. Available:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc91692/.
[60] C. Sousa, P. Kotrba, T. Ruml, A. Cebolla, and V. De Lorenzo, “Metalloadsorption by Escherichia coli cells displaying yeast and mammalian metallothioneins anchored to the outer membrane protein LamB,” J. Bacteriol., vol. 180, no. 9, pp.
44 2280–2284, 1998, doi: 10.1128/jb.180.9.2280-2284.1998.
[61] I. M. Taylor, J. L. Harrison, K. N. Timmis, and C. D. O’Connor, “The TraT