- Mẫu Chè (khô): 280g lá Chè (khô) được ngâm chiết với 1000 ml etanol trong 24 giờ ở nhiệt độ thường, có sử dụng siêu âm, thu dịch chiết lần 1, ép bã rồi tiếp tục
2.4.3. Chiết, tách và phân lập các chất từ nguyên liệu Chè (khô)
Nguyên liệu Chè (khô) được chiết và tách theo hình 2.3.a và 2.3.b
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 31
Hình 2.3.b.Sơ đồ chiết, tách các chất từ cao chè tổng từ Chè (khô) phụ phẩm
Cao chè thu được từ nguyên liệu Chè phụ phẩm (khô) chiết nước nóng (CK, 100 gam) được hòa tan hoàn toàn vào nước, dùng CH2Cl2 chiết lặp lại 4 lần . Dung dịch được cô quay bằng máy quay cất chân không dưới áp suất giảm thu được 38,6 gam cặn dịch chiết. Sau đó dùng EtOAc chiết lại pha nước, cũng chiết lặp lại 4 lần thu được 22 gam cặn chiết EtOAc.
Cặn chiết EtOAc (22 gam) được tách bằng sắc ký cột (đường kính cột d= 40mm; chiều dài lớp sephadex l=400mm) rửa giải bằng hệ dung môi MeOH. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), hệ dung môi là CH2Cl2:MeOH với các tỷ lệ môi khác nhau, hiện hình bằng UV bước sóng λ =360nm thu được 6 nhóm phân đoạn. Các phân đoạn được ký hiệu từ CX1 đến CX6 tương ứng với các số gam là (2,0; 2,6; 1,0;10,3; 2,5 và 2,6 gam). Silicagel/CH2Cl2:MeOH Silicagel/CH2Cl2:MeOH CXN4 136mg CX4.5 7,4g SKC Diaion/MeOH:H2O = 7:3 D4 1,9g D7 D6 D5 D3 420mg D1 D2 450mg SKC Sephadex/MeOH CXN2 160mg CXN3 4mg
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 32
Phân đoạn CX4 (10,3gam) phân tích bằng phương pháp sắc ký cột (đường kính cột d= 30mm; chiều dài lớp sephadex l=400mm) rửa giải bằng hệ dung môi MeOH. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), hệ dung môi là CH2Cl2:MeOH với các tỷ lệ khác nhau, hiện hình bằng UV bước sóng λ =360nm thu được 5 nhóm phân đoạn. Các phân đoạn được ký hiệu từ CX4.1 đến CX4.5 tương ứng với các số gam (0,4; 1,6; 0,3; 0,6 và 7,4 gam).
Phân đoạn CX4.5 (7,4gam) được tách bằng sắc ký cột (đường kính cột d= 60mm; chiều dài lớp Diaion l=600mm) với 300 gam chất hấp phụ Diaion hệ dung môi rửa giải là MeOH:H2O (7:3). Thu được 7 phân đoạn. Các phân đoạn được ký hiệu từ D1 đến D7.
Phân đoạn D2 (450mg) phân tích bằng phương pháp sắc ký cột với Sephadex dung môi rửa giải là MeOH. Kiểm tra độ tinh khiết của các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), hệ dung môi là CH2Cl2:MeOH ở các tỉ lệ khác nhau; hiện hình bằng UV bước sóng λ =360nm. Sau khi gộp các phân đoạn giống nhau lại thu được chất sạch ký hiệu là CXN2 (160mg).
Phân đoạn D3 (420mg) được tách bằng sắc ký cột (đường kính cột d= 20mm; chiều dài lớp silicagel l=400mm) với 30gam chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063mm) rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (98:2) sau đó tăng dần đến tỉ lệ 1:1 Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), hệ dung môi là CH2Cl2:MeOH (9:1) hiện hình bằng UV bước sóng λ =360nm thu được chất sạch ký hiệu là CXN3 (4mg).
Từ 1,9 gam phân đoạn D4 được tách bằng sắc ký cột trên silicagen (đường kính cột d = 25mm; chiều dài lớp silicagen l = 600mm); với 100 gam chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063mm), rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (98:2). Sau đó tăng dần đến tỉ lệ 95:5 và chạy cột tiếp đến tỉ lệ 1:1. Sau đó dội cột hoàn toàn bằng MeOH và kiểm tra độ tinh khiết của các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), hệ dung môi là CH2Cl2:MeOH ở các tỉ lệ khác nhau; hiện hình bằng UV bước sóng λ =360nm. Sau khi gộp các phân đoạn giống nhau lại thu được chất ký hiệu là CXN4 (136mg). Sắc ký lớp mỏng so sánh với mẫu catechin cho kết quả dự đoán chất chính là catechin.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 33
CHƢƠNG 3